【技術實現步驟摘要】
本申請涉及病原體分子檢測，尤其涉及檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的引物探針組、試劑盒及方法。
技術介紹
1、手足口病(hand，foot?and?mouth?disease，hfmd)是一類由多種腸道病毒引起的常見傳染病，通過消化道、呼吸道及接觸等方式傳播，好發于5歲以下兒童，主要表現為發熱以及手、足、口腔等部位出現斑丘疹、皰疹。部分病例可并發腦膜炎、心肌炎和神經系統癥狀等，病情嚴重時，可致死亡或留有后遺癥。
2、皰疹性咽峽炎(herpangina,ha)主要感染病毒與hfmd相同，通過消化道、呼吸道為主要傳播途徑，是一種好發于嬰幼兒且傳染性較強，傳播快，具有與呼吸道感染類似的一般癥狀；主要表現為口腔后部發生區域性潰瘍。
3、柯薩奇病毒a6(coxsackievirusa6，簡稱ca6)和柯薩奇病毒a10(coxsackievirusa10，簡稱ca10)都屬于小rna病毒科的腸道病毒a組，和家系其他腸道病毒一樣，這兩個基因組編碼4種結構蛋白(vp4、vp2、vp3和vp1)和7個非結構蛋白(2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d)。vp1蛋白在腸道病毒子表面高度表達。它因為含有中和表位，在病毒的發病機制中起著重要的作用。
4、手足口病和皰疹性咽峽炎的主要致病原為腸道病毒a組71型(enterovirus?71，ev71)和柯薩奇病毒a組16型(coxsackievirus?a16，cva16)，其中，ca6型及ca10型是感染手足口病的常見原因，其所致的手足口病常引發一系列非典型癥狀，如伴
5、目前，現有的柯薩奇病毒a6型/a10型核酸檢測的試劑盒，儀器擴增檢測時間都在2小時左右，最低檢出限在500copies/ml及以上，擴增檢測時間及檢測靈敏度還有待優化。因此，亟需靈敏度更高、檢測更加快速的a6/a10檢測方法。
技術實現思路
1、本申請實施例的目的在于提出一種檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的引物探針組、試劑盒及方法，有效提高檢測靈敏度和檢測速度。
2、為了解決上述技術問題，本申請實施例提供一種檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的引物探針組，采用了如下所述的技術方案：
3、一種檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的引物探針組，包括：針對a6型的正向引物，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示；
4、針對a6型的反向引物，其核苷酸序列如seq?id?no.2所示；
5、針對a6型的探針，其核苷酸序列如seq?id?no.3所示；
6、針對a10型的正向引物，其核苷酸序列如seq?id?no.4所示；
7、針對a10型的反向引物，其核苷酸序列如seq?id?no.5所示；
8、針對a10型的探針，其核苷酸序列如seq?id?no.6所示；
9、內標正向引物，其核苷酸序列如seq?id?no.7所示；
10、內標反向引物，其核苷酸序列如seq?id?no.8所示；
11、內標探針，其核苷酸序列如seq?id?no.9所示。
12、進一步的，所述針對a6型的探針的5’端結合有熒光發生基團fam，3’端結合有熒光淬滅基團eclipse+5zip；
13、和/或，所述針對a10型的探針的5’端結合有熒光發生基團vic，3’端結合有熒光淬滅基團eclipse+5zip；
14、和/或，所述內標探針的5’端結合有熒光發生基團cy5，3’端結合有熒光淬滅基團bhq2。
15、進一步的，所述seq?id?no.1對應的核苷酸序列從5’端至3’端為catagatgtgatgggcttcgtg；
16、所述seq?id?no.2對應的核苷酸序列從5’端至3’端為ggacacaaaagtgaactcggc；
17、所述seq?id?no.3對應的核苷酸序列從5’端至3’端為cgcaagctagagttatcaacatac；
18、所述seq?id?no.4對應的核苷酸序列從5’端至3’端為gcaaacagcaactaacccatcagt；
19、所述seq?id?no.5對應的核苷酸序列從5’端至3’端為ctagctggtgacatgaaaggaac；
20、所述seq?id?no.6對應的核苷酸序列從5’端至3’端為ctcactgaccctcctgcacaagt；
21、所述seq?id?no.7對應的核苷酸序列從5’端至3’端為ctcctccacctttgacgctg；
22、所述seq?id?no.8對應的核苷酸序列從5’端至3’端為caccctgttgctgtagccaa；
23、所述seq?id?no.9對應的核苷酸序列從5’端至3’端為agtggtcgttgagggcaatgcc。
24、為了解決上述技術問題，本申請實施例還提供一種檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的試劑盒，采用了如下所述的技術方案：
25、一種檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的試劑盒，所述試劑盒包括pcr反應液，所述pcr反應液包括上述的引物探針組。
26、進一步的，所述引物探針組的引物的濃度均為0.4mmol/l；
27、所述引物探針組的探針的濃度均為0.04～0.08mmol/l。
28、進一步的，所述pcr反應液還包括ph值為8.8的40mmol/l的tris-hcl、1～10mmol/l的mgcl2、10～50mmol/l的kcl以及5～10mmol/l的(nh4)so4。
29、進一步的，所述試劑盒還包括pcr反應酶系，所述pcr反應酶系包括熱啟動taq抗體酶、c-mmlv酶、udg酶以及dutps。
30、進一步的，在每人份的pcr反應酶系中，所述熱啟動taq抗體酶的濃度為5～10u；
31、所述c-mmlv酶的濃度為5～10u；
32、所述udg酶濃度為0.5～1u；
33、所述dutps的濃度為6～12mmo?l。
34、為了解決上述技術問題，本申請實施例還提供一種檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的方法，采用了如下所述的技術方案：
35、一種使用上述的試劑盒檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的方法，包括以下步驟：
36、將pcr反應液與pcr反應酶系混合均勻，獲得pcr擴增液，其中，所述pcr反應液包括上述的引物探針組；
37、將預先提取的待測樣本的核酸加入所述pcr擴增液中，置于實時熒光定量pcr儀中進行pcr擴增反應，收集熒光信號；
38、根據所述熒光信號分析獲得檢測結果。
39、進一步的，所述pcr擴增反應的條件設定為：
40、50℃2分鐘；
41、95℃5分鐘；
42、95℃5秒至6本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的引物探針組，其特征在于，包括：針對A6型的正向引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；
2.根據權利要求1所述的檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的引物探針組，其特征在于，所述針對A6型的探針的5’端結合有熒光發生基團FAM，3’端結合有熒光淬滅基團Eclipse+5zip；
3.根據權利要求1所述的檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的引物探針組，其特征在于，所述SEQ?ID?NO.1對應的核苷酸序列從5’端至3’端為CATAGATGTGATGGGCTTCGTG；
4.一種檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括PCR反應液，所述PCR反應液包括如權利要求1至3任一項所述的引物探針組。
5.根據權利要求4所述的檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的試劑盒，其特征在于，所述引物探針組的引物的濃度均為0.4mmol/L；
6.根據權利要求4所述的檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液還包括pH值為8.8的40mmol/L的Tris-HC
7.根據權利要求4所述的檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應酶系，所述PCR反應酶系包括熱啟動Taq抗體酶、C-MMLV酶、UDG酶以及dUTPs。
8.根據權利要求7所述的檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的試劑盒，其特征在于，在每人份的PCR反應酶系中，所述熱啟動Taq抗體酶的濃度為5～10U；
9.一種使用如權利要求4至8任一項所述的試劑盒檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.根據權利要求9所述的檢測柯薩奇病毒A6型和A10型的方法，其特征在于，所述PCR擴增反應的條件設定為：
...【技術特征摘要】
1.一種檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的引物探針組，其特征在于，包括：針對a6型的正向引物，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示；
2.根據權利要求1所述的檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的引物探針組，其特征在于，所述針對a6型的探針的5’端結合有熒光發生基團fam，3’端結合有熒光淬滅基團eclipse+5zip；
3.根據權利要求1所述的檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的引物探針組，其特征在于，所述seq?id?no.1對應的核苷酸序列從5’端至3’端為catagatgtgatgggcttcgtg；
4.一種檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括pcr反應液，所述pcr反應液包括如權利要求1至3任一項所述的引物探針組。
5.根據權利要求4所述的檢測柯薩奇病毒a6型和a10型的試劑盒，其特征在于，所述引物探針組的引物的濃度均為0.4mmol/l；
6.根據權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣析文，林衛萍，黃祖彬，董子維，陳悅寧，廖麗麗，
申請(專利權)人：廣州達安基因股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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