【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于番茄轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子育種領(lǐng)域，其具體涉及到一種運(yùn)用crispr/cas9系統(tǒng)對(duì)slknu基因進(jìn)行編輯，從而造成slknu突變，創(chuàng)制果實(shí)增大且心皮增多的番茄突變體的方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、果實(shí)是一種植物器官，是由花經(jīng)過授粉受精后，花藥、花絲、花托等雄蕊部分凋謝，子房發(fā)育而來的。經(jīng)過授粉受精后，子房?jī)?nèi)的胚珠發(fā)育成種子，而子房則發(fā)育成為果實(shí)。子房與花柱和柱頭等部位構(gòu)成單雌蕊或復(fù)雌蕊，其中單雌蕊是由單個(gè)心皮構(gòu)成的雌蕊，復(fù)雌蕊是由兩個(gè)以上的心皮聯(lián)合構(gòu)成的雌蕊。心皮數(shù)的確定受到花分生組織(floralmeristem，fm)活性的影響，當(dāng)各輪花器官原起始完畢，fm活性便程序性終止，從而心皮數(shù)確定，最終形成確定數(shù)目的果實(shí)小室。
2、當(dāng)植物從營養(yǎng)生長過渡到生殖生長后，sam轉(zhuǎn)化為花序分生組織(inflorescencemeristem，im)，在im的周圍產(chǎn)生fm，最終形成花器官，因此fm的活性維持與適時(shí)終止對(duì)花的正常發(fā)育至關(guān)重要。擬南芥fm活性終止是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的調(diào)控過程，在莖頂分生組織(shootapical?meristem，sam)和fm中，具有同源異形結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子wuschel(wus)能夠特異性的維持干細(xì)胞的活性，對(duì)fm活性的維持和終止發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)花發(fā)育到第6～7期，雌蕊原基起始完成，為了保證花器官的確定性應(yīng)當(dāng)及時(shí)終止fm的活性。在花發(fā)育到第6期時(shí)，編碼一個(gè)c2h2型鋅指蛋白的knuckles(knu)基因開始表達(dá)，其蛋白可以直接結(jié)合到wus的啟動(dòng)子區(qū)，并通過招募polycomb-grou
3、在番茄(solanum?lycopersicum)中，位于slwus基因下游的15-bp阻遏元件中的核苷酸多態(tài)性會(huì)造成不同品種間果實(shí)小室數(shù)量的差異。番茄果實(shí)小室數(shù)的增加會(huì)導(dǎo)致大約30％果實(shí)產(chǎn)量的增加，具有非常重要的農(nóng)藝學(xué)意義，因此通過對(duì)番茄中slwus表達(dá)調(diào)控研究，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)番茄果實(shí)產(chǎn)量的控制。knu基因功能相對(duì)保守，在番茄中也存在一個(gè)編碼c2h2型鋅指蛋白的slknu基因，其蛋白可以直接結(jié)合到slwus啟動(dòng)子區(qū)實(shí)現(xiàn)對(duì)slwus的表達(dá)抑制。
4、通過傳統(tǒng)育種想要獲得優(yōu)良形狀的品種需要耗費(fèi)大量的人力、物力、財(cái)力，以及漫長的時(shí)間周期。因此降低時(shí)間成本，縮短育種年限，減少人力、物力、財(cái)力，降低工作量，在最短的時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)良性狀的品種一直是育種家最為關(guān)注的問題。強(qiáng)大的基因編輯工具crispr/cas9的誕生，能夠在不引入外源基因的前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源目的基因的定點(diǎn)編輯，從而獲取目的性狀品種。crispr/cas9作為一項(xiàng)高效的植物遺傳改良和分子育種的基因編輯工具，其操作簡(jiǎn)單、成本低廉、編輯效率高，而且由于沒有引進(jìn)外源基因與常規(guī)轉(zhuǎn)基因植物具有明顯的不同，在農(nóng)作物遺傳改良中的應(yīng)用前景十分廣闊。但是，到目前為止，尚未有運(yùn)用crispr/cas9技術(shù)進(jìn)行敲除slknu基因后獲得果實(shí)增大的多心皮番茄的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于通過基因編輯技術(shù)創(chuàng)制番茄心皮增多及果實(shí)增大的方法及應(yīng)用，該方法運(yùn)用了crispr/cas9基因編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)slknu基因的定點(diǎn)突變，使slknu基因功能完全喪失，從而獲得穩(wěn)定遺傳且無外源基因插入的果實(shí)增大的多心皮番茄。意在提高番茄的產(chǎn)量，從而明顯擴(kuò)大番茄種植的經(jīng)濟(jì)效益。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供了以下技術(shù)方案：
3、利用crispr/cas9系統(tǒng)編輯一個(gè)番茄基因以增大果實(shí)的方法及應(yīng)用，包括以下步驟：
4、(1)grna的靶位點(diǎn)的選擇：根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)在番茄中有三個(gè)與擬南芥中knu高度同源的基因，分別是solyc00g014800、c2h2_sl2.50ch12以及slknu，其中這三個(gè)基因都具有c2h2結(jié)構(gòu)域，而只有slknu具有ear結(jié)構(gòu)域，這與擬南芥中knu一樣，為此選擇slknu基因作為編輯的靶基因，根據(jù)crispr/cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站https：//cctop.cos.uni-heidelberg.de/，選擇兩個(gè)靶點(diǎn)，其中一個(gè)靶點(diǎn)在c2h2結(jié)構(gòu)域之前，另一個(gè)靶點(diǎn)選擇在ear結(jié)構(gòu)域之前，因?yàn)閗nu基因的功能發(fā)揮依賴于這兩個(gè)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域；
5、第一個(gè)grna靶位點(diǎn)的序列為：5’cacccacctagtttatgatt3’；
6、第二個(gè)grna靶位點(diǎn)的序列為：5’ccgttttctatcctccgccg3’；
7、(2)grna片段的引物設(shè)計(jì)：根據(jù)crispr/cas9引物設(shè)計(jì)原則，grna片段的引物設(shè)計(jì)為：
8、第一個(gè)靶點(diǎn)的上游引物grna-f-1：
9、5’-atatatggtctcgattgctggggcaacggagttagacgttttagagctagaaatagc-3’
10、第一個(gè)靶點(diǎn)的下游引物grna-r-1：
11、5’-attattggtctcgaaaccagctgaatctcgaccttacaatctcttagtcgactctac-3’
12、第二個(gè)靶點(diǎn)的上游引物grna-f-2：
13、5’-atatatggtctcgattgaatcataaactaggtgggtggttttagagctagaaatagc-3’
14、第二個(gè)靶點(diǎn)的下游引物grna-r-2：
15、5’attattggtctcgaaacccgttttctatcctccgccgcaatctcttagtcgactctac3’
16、(3)grna表達(dá)載體的構(gòu)建：以質(zhì)粒pcbc-dt1t2為模板，分別用grna-f/r引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增、純化最后獲得grna片段；然后用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)pcr產(chǎn)物和載體進(jìn)行切割，并通過t4dna連接酶將酶切產(chǎn)物和載體進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物后通過大腸桿菌轉(zhuǎn)化然后篩選陽性克隆并通過質(zhì)粒提取獲得crispr/cas9-grna表達(dá)載體。
17、(4)將crispr/cas9-grna表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化gv3101農(nóng)桿菌，得到含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，并用含有crispr/cas9-grna的農(nóng)桿菌并侵染野生型micro-tom番茄。
18、(5)通過步驟(4)獲得的愈傷組織經(jīng)過潮霉素抗性篩選后誘導(dǎo)得到再生苗并通過篩選獲得轉(zhuǎn)基因陽性苗。
19、(6)通過(5)獲得的陽性轉(zhuǎn)基因苗，剪取少許葉片進(jìn)行提取基因組dna，然后通過在cas9基因序列上設(shè)計(jì)一對(duì)引物，pcr擴(kuò)增后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)明亮合適大小的條帶即為成果轉(zhuǎn)入crispr/cas9表達(dá)載體的陽性苗，然后再在兩個(gè)靶位點(diǎn)前后個(gè)100bp分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，分析靶點(diǎn)附近是否存在基因編輯，如果是純合突變，則通過表型進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)觀察，并收取自交后產(chǎn)生的種子，然后將種子種下并篩選不含有cas9的株系本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于：
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于：
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于：
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于：
7.權(quán)利要求1～6任一項(xiàng)所述的一種利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法制備的心皮增多且果實(shí)增大的番茄突變體在番茄育種中的應(yīng)用。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心皮番茄材料的方法，其特征在于：
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制果實(shí)增大的多心...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫博，李東保，楊文，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。