【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥，涉及一種用于酶的化學發光探針及其合成方法和應用，具體為測定cyp3a的特異性化學發光探針、制備方法及應用。
技術介紹
1、細胞色素p450s酶(cyp)是一類包含亞鐵血紅素的重要單加氧化酶超家族，這些酶主要定位于內質網這樣的亞細胞器中，p450酶涉及多種催化反應類型，包括羥化、環氧化、n-脫烷基和o-脫烷基等反應。cyp3a作為p450s種最重要的i相藥物代謝酶，參與了最廣泛的內源性和外源性物質的代謝。這些物質包括大多數藥物和毒物，對維持人體正常生理功能至關重要，因此，了解和研究cyp3a酶的功能和調節機制對于藥物安全性和個體化治療具有重要意義。
2、然而由于服用藥物、遺傳多態性和環境因素等的影響，個體之間的p450酶活性存在較大的差異性，這可能導致多種不良影響，例如，cyp3a受到遺傳多態性的影響，可能引發藥物性肝損傷(dili)，此外，cyp3a的活性還會受到抑制或激活而引發藥物間相互作用(ddi)，例如，利福平通過上調p4503a酶的活性，導致患者在使用含利托那韋的抗逆轉錄病毒藥物時產生有毒產物，從而引發氧化應激和肝細胞損傷，cyp3a活性的變化是引發藥物間相互作用的最常見原因。因此，選擇適當的檢測方法來精確評估cyp3a酶的活性具有重要意義，這樣可以更好地了解個體在藥物代謝和相互作用方面的特點，從而更安全地使用藥物并減少不良反應的風險。
3、目前檢測方法中，關于cyp3a的檢測方法主要有紫外光譜法、蛋白質學、免疫印跡法和熒光探針檢測法，紫外光譜法可以基于cyp3a對底物的氧
4、如專利cn101608212b提到，利用五味子甲素作為cyp3a的特異性探針，該方法通過質譜技術評價cyp3a的活性，具體是通過測定五味子甲素底物的減少量或五味子醇甲產物的生成量。然而，該方法對樣品制備要求較高，成本昂貴，且技術復雜；同時，檢測過程受到離子化效率差異和基質效應的影響，存在一定局限性。又如專利cn104975066b提到，通過紫外吸收法檢測底物寡糖酯類化合物tenuifoliside?a的減少量或其對應羥化產物的生成量，以定量不同生物樣本中的cyp3a4。然而，該方法易受到復雜生物樣本中具有相似紫外吸收波長物質的干擾，導致區分度較差；此外，紫外吸收檢測法對低濃度樣品的靈敏度有限，信噪比亦較低，極大限制了其應用范圍。專利cn114105979a提出了一種基于利于萘酰亞胺類熒光團的4-位羥化反應作為探針反應用于檢測cyp3a活性，并可用于體外快速篩選cyp3a的可逆及不可逆抑制劑、激活劑及誘導劑。然而，該熒光探針法激發波長較短，容易引起較高的背景熒光。相比之下，基于化學發光激活的cyp3a探針檢測方法由于依賴的是化學反應形成的發射性激發態的自發光體系，無需外部激發光源的照射，因此沒有外部激發光源引發的自發光和光散射，可以實現生物基質的零干擾，極大地提高了檢測的靈敏度和信噪比，同時實現了在復雜生物體系中的實時成像。盡管如此，目前還沒有化學發光的人源性cyp3a探針底物的報道。
技術實現思路
1、本專利技術針對現有技術的不足，提供了一種無需外部光源激發的cyp3a化學發光探針，并結合了全新的cyp3a氧化脫烷基的響應基團，該探針與傳統熒光探針相比具有超高的信噪比和靈敏度同事還可以實現生物基質的零干擾，利用該探針可以對復雜生物體系內的cyp3a的酶活性檢測和分布進行測量和定位。
2、本專利技術的目的之一是提供一種化學發光探針lp，其特征在于，其結構特征如下式所示：
3、
4、具體包括選擇性響應基團r1、自離去基團r2、自增色基團r3和化學發光基團r4；所述r1選自：1-乙基-3-氟苯、乙基苯、甲基、乙基、氯乙基或溴乙基；r2選自：氫、氟、氯、溴或碘；r3選自三氰基呋喃、氰基、乙酸、乙酸甲酯、喹啉腈、吡喃腈、半花菁或甲基喹啉腈；r4選自：氫、氟、氯、溴或碘。
5、進一步的，當r1為1-乙基-3-氟苯，r2為氰基，r3為氯，r4為氯時，化學發光探針lp命名為3-(3-氯-2-((3-氯-4-((3-氟芐基)氧基)芐基)氧基)-4-甲氧基螺[金剛烷-2,3'-[1,2]二氧雜環丁烷]-4'-基)苯基)丙烯腈(lp-01)。
6、本專利技術的目的之二是提供化學發光探針lp的制備方法，合成路線如下所示：
7、
8、利用光延反應將觸發基團lh與化學發光母體lc連接在一起得到cyp3a特異性化學發光探針lp。
9、進一步的，lh的合成路線為：
10、通過芐基化親核反應將自離去基團r2與響應基團r1進行連接，再通過硼氫化鈉還原得到觸發基團lh。
11、進一步的，lc的合成路線為：
12、
13、r4,-3-羥基苯甲醛經過6步反應到化學發光母體lm，依次為r4,-3-羥基苯甲醛與原甲酸三甲酯及四丁基三溴化銨的縮醛反應，2-氯-3-二甲氧基甲苯酚的酚羥基的硅醚保護，緊接著是在四氯化鈦的催化下與亞磷酸三甲酯的磷酸酯化反應，然后進一步在二異丙基氨基鋰的催化下與金剛烷酮親核加成，再用鹽酸脫去羥基的硅醚鍵保護，最后與多聚甲醛發生醛基化反應，再通過維蒂希反應，莫爾基反應和醛基的親核加成修飾化學發光母體lm得到不同增色團修飾的化學發光母體lc。
14、本專利技術首次將schaap-二氧雜環丁烷(lm)化學發光系統引入cyp3a檢測體系中，lm具備較大的分子結構，專利技術人對增色基團部分進行了相應的堿性基團修飾，如氰基和吡喃腈等，以期獲得對cyp3a活性位點有效識別的化學發光母體(lc)，此設計充分考慮了cyp3a活性空腔的特性，包括其對疏水性、中堿性和較大底物分子的偏好。
15、在lc的觸發端中，專利技術人設計了一系列cyp3a可識別的觸發基團(lh)，包括甲氧基、三氟甲基和二異丙基縮醛等，其中，首次引入了以往cyp3a探針中未出現的觸發結構：1-氯-2-(3-氟苯基)甲氧基(lh-01)，該基團源自于cyp3a藥物底物lapatinib的啟發，展現出對cyp3a的高選擇性。
16、此外，為了便于cyp3a觸發基團lh有效進入cyp3a活性空腔，專利技術人在lc與lh之間構建了連接基團，經cyp3a催化后，觸發基團lh將導致連接基團發生電子重排并自離去，釋放出苯氧負離子的高能不穩定中間態的二氧雜環丁烷。通過電子交換發光機制本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種化學發光探針LP，其特征在于，其結構特征如下式所示：
2.根據權利要求1所述的一種化學發光探針LP，其特征在于，當R1為1-乙基-3-氟苯，R2為氰基，R3為氯，R4為氯時，化學發光探針LP命名為3-(3-氯-2-((3-氯-4-((3-氟芐基)氧基)芐基)氧基)-4-甲氧基螺[金剛烷-2,3'-[1,2]二氧雜環丁烷]-4'-基)苯基)丙烯腈。
3.根據權利要求1所述的化學發光探針LP的制備方法，其特征在于，合成路線如下所示：
4.根據權利要求3所述的化學發光探針LP的制備方法，其特征在于，LH的合成路線為：
5.根據權利要求1所述的化學發光探針LP的制備方法，其特征在于，LC的合成路線為：
6.如權利要求1所述化學發光探針LP在測定CYP3A活性中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，將探針與含CYP3A的生物樣品混合后進行酶促反應，通過定量收集檢測單位時間內產生的化學發光信號或對應產物苯甲酸酯的生成率來定量測定不同生物體系中CYP3A的活性。
8.根據權利要求7所述的應
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，含CYP3A的生物樣品包括CYP3A的人肝微粒體、S9、動物或者人類組織制備液以及對應的組織細胞及其制備物中的任意一種。
...【技術特征摘要】
1.一種化學發光探針lp，其特征在于，其結構特征如下式所示：
2.根據權利要求1所述的一種化學發光探針lp，其特征在于，當r1為1-乙基-3-氟苯，r2為氰基，r3為氯，r4為氯時，化學發光探針lp命名為3-(3-氯-2-((3-氯-4-((3-氟芐基)氧基)芐基)氧基)-4-甲氧基螺[金剛烷-2,3'-[1,2]二氧雜環丁烷]-4'-基)苯基)丙烯腈。
3.根據權利要求1所述的化學發光探針lp的制備方法，其特征在于，合成路線如下所示：
4.根據權利要求3所述的化學發光探針lp的制備方法，其特征在于，lh的合成路線為：
5.根據權利要求1所述的化學發光...
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。