【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于生物，涉及一種狂犬病病毒環(huán)狀rna分子的制備及其應用，具體涉及一種編碼狂犬病病毒g蛋白環(huán)狀rna的制備及應用；包含編碼狂犬病病毒g截短加突變蛋白序列的環(huán)狀rna、線性rna、重組質粒、重組大腸桿菌工程菌，以及環(huán)狀rna的制備方法及應用。
技術介紹
1、狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies?virus，rv)引起的一種致命的神經系統(tǒng)疾病，是目前已知的最致命的人畜共患傳染疾病之一，對于狂犬病，目前沒有特效藥物，患者一旦出現(xiàn)臨床癥狀，幾乎100％致死，可通過接種疫苗從暴露前預防(pre-exposureprophylaxis，prep)和及時有效的暴露后預防(post-exposure?prophylaxis，pep)來控制。人類感染狂犬病主要由被感染的動物如犬、貓咬傷抓傷，提前為與人類密切接觸的動物注射疫苗來預防狂犬病，是減少人類因動物感染狂犬病的重要策略。
2、rabv屬于彈狀病毒科(rhabdoviridae)狂犬病毒屬(lyssavirus)，電鏡下的rabv病毒粒子呈子彈狀。rabv基因組約為12,000nt，是單股負鏈rna病毒，編碼磷蛋白(phosphoprotein，p)、核蛋白(nucleoprotein，n)、糖蛋白(glycoprotein，g)、聚合酶(polymerase，l)和基質蛋白(matrixprotein，m)五個結構蛋白，其中g蛋白是唯一暴露在病毒囊膜表面的蛋白，是細胞受體的唯一配體，也是已知誘導宿主產生病毒中和抗體(virusneutralizing?an
3、對狂犬病最有效的預防手段依舊是接種疫苗，目前市售的狂犬病疫苗主要為狂犬病毒滅活疫苗，由活病毒毒株經細胞培養(yǎng)擴增、滅活、乳化等工藝制成，為狂犬病疾病預防起到了重要作用。但該疫苗在實際應用中也存在許多缺點：(1)使用細胞培養(yǎng)生產病毒，存在病毒株泄露、滅活不徹底的風險，存在一定的安全隱患。(2)質量控制和工藝放大要求高，生產成本高。(3)使用完全滅活病毒作為抗原，需要較大劑量免疫，而且需要多次免疫以發(fā)揮持久的保護。關于成本更低、更持久高效的狂犬病病毒新型疫苗的研制還有待突破。
4、mrna疫苗是將含有編碼抗原蛋白的mrna直接導入機體，使其在體內直接翻譯，完成目標蛋白的表達，從而引起機體特異的免疫反應，已在人重大呼吸道傳染病的預防方面發(fā)揮重要作用。目前在臨床或臨床前應用的mrna主要為線性mrna，線性mrna的結構包括5’帽子結構(5’cap)，3’多聚腺苷尾巴(polya?tail)，5’非翻譯序列(5’untranslationalregion，5’utr)，3’非翻譯序列(3’untranslational?region，3’utr)以及開放閱讀框(openreading?frame，orf)等。5’帽子結構是真核生物mrna的基本特征，通過在mrna?5’末端加入n7-甲基鳥苷而得。5’帽子結構和3’多聚腺苷尾巴是線性rna的必要組件，能有效防止mrna降解，并促進mrna翻譯成蛋白。5’帽子結構通過與翻譯起始復合物eif4e結合而促進mrna翻譯，并能有效防止mrna降解，降低mrna的免疫源性。3’多聚腺苷尾巴的主要功能是通過與polya結合蛋白(polya?binding?protein，pabp)結合，后者與eif4g及eif4e相互作用，介導mrna形成環(huán)形，并促進翻譯進程，防止mrna降解。
5、環(huán)狀rna(circular?rnas，circrnas)是真核生物常見的一種rna類型。目前體外構建環(huán)狀rna最高效的技術為自剪切成環(huán)系統(tǒng)設計技術(專利cn?114574483?a)，該技術設計原理是通過分子克隆法將外顯子e1與e2序列首尾相接，形成連續(xù)的環(huán)狀質粒。通過限制性內切酶將內含子剪切斷裂，得到線性質粒。再通過倒置的3’內含子上游的t7啟動子進行體外轉錄，得到包含3’內含子-e2-e1-5’內含子結構的線狀rna。與天然的i類內含子系統(tǒng)類似，外顯子e1的特定的剪切位點保守序列受游離的鳥苷酸3’羥基的親核進攻而發(fā)生斷裂，外顯子e1產生裸露的3’羥基，而鳥苷酸則結合在斷裂的5’內含子上。其后，外顯子e1的裸露的3’羥基對3’內含子與外顯子e2之間的保守序列進行進攻，將3’內含子切除，而外顯子e2與e1發(fā)生成環(huán)反應，得到環(huán)狀的e1-e2?rna。與線性mrna相比，環(huán)狀mrna分子往往具有較長的半衰期，具有更好的穩(wěn)定性，在蛋白表達、臨床治療中具有重要的應用前景。此外，基于自剪切成環(huán)系統(tǒng)設計環(huán)狀rna的制備工藝更加簡便，工藝成本更低，在轉錄后僅成環(huán)處理，不需要使用昂貴的加帽酶和加尾酶進行額外的5’帽子結構和3’多聚腺苷尾巴結構的修飾，也不需要如傳統(tǒng)環(huán)狀rna一般使用t4?rna連接酶進行額外的成環(huán)工藝。此外能夠避免在環(huán)狀rna中引入額外的外顯子序列，提高環(huán)狀rna分子的序列精確度。
6、目前環(huán)狀rna主要應用于人用蛋白/疫苗表達研究，尚未有關于狂犬病病毒環(huán)狀rna分子優(yōu)化設計和應用的報道。
技術實現(xiàn)思路
1、針對正在臨床應用的狂犬病滅活疫苗和在研究的線性rna疫苗存在的問題：包括狂犬病滅活疫苗存在滅活不徹底、病毒株泄露的風險、生產成本高，以及已報道的狂犬病線性rna疫苗需要多次注射以維持長期保護(doi：10.3389/fimmu.2022.1099991)等，本專利技術提供一種狂犬病病毒環(huán)狀rna分子的制備及應用。該環(huán)狀rna分子含有優(yōu)化的狂犬病病毒g蛋白的編碼元件和優(yōu)化的翻譯起始元件，其可誘導蛋白表達、能誘導動物產生更高水平中和抗體且僅需一次給藥能維持藥效1年，為制備預防和/或治療狂犬病的環(huán)狀mrna疫苗提供基礎。
2、用于解決問題的方案：
3、<環(huán)狀rna>
4、本專利技術提供了一種環(huán)狀rna，所述環(huán)狀rna包含編碼元件，所述編碼元件編碼包含狂犬病病毒g蛋白的多肽。進一步地，g野生型蛋白、g截短蛋白、g突變蛋白、g截短加突變蛋白；優(yōu)選編碼元件編碼g截短加突變蛋白。本專利技術所述的環(huán)狀rna可以通過傳統(tǒng)pie系統(tǒng)制備得到，也可以通過clean?pie系統(tǒng)制備得到。
5、在一些實施方案中，所述編碼元件編碼狂犬病病毒g蛋白的氨基酸序列包含如seqid?no.3所示的序列，或與seq?id?no.3所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有g蛋白活性的序列。
6、在一些實施方案中，所述編碼元件編碼包含以下任意一項：狂犬病病毒g蛋白n端截短19個氨基酸、n端截短19個氨基酸/c端截短13個氨基酸、n端截短19個氨基酸/c端截短14個氨基酸、包含突變w33q、包含突變w33p、包含突變t335y、包含突變e356f、包含突變e356i、包含突變w33q/e356i、n端截短19個氨基酸/w33q/e356i、n端截短19個氨基酸/c端截短13個氨基酸/w33q/e356i、野生型g蛋白。
7、本專利技術中，所述本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種環(huán)狀RNA，其特征在于，所述環(huán)狀RNA包含編碼元件，所述編碼元件編碼包含狂犬病病毒G蛋白的多肽。
2.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)狀RNA，其特征在于，所述編碼元件編碼狂犬病病毒G蛋白的氨基酸序列包含如SEQ?ID?NO.3所示的序列，或與SEQ?ID?NO.3所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有G蛋白活性的序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的環(huán)狀RNA，其特征在于，所述編碼元件編碼包含以下任意一項：狂犬病病毒G蛋白N端截短19個氨基酸、N端截短19個氨基酸/C端截短13個氨基酸、N端截短19個氨基酸/C端截短14個氨基酸、包含突變W33Q、包含突變W33P、包含突變T335Y、包含突變E356F、包含突變E356I、包含突變W33Q/E356I、N端截短19個氨基酸/W33Q/E356I、N端截短19個氨基酸/C端截短13個氨基酸/W33Q/E356I、野生型G蛋白。
4.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)狀RNA，其特征在于，所述編碼元件編碼狂犬病G蛋白的核苷酸序列包含如SEQ?ID?NO.4所示的序列，或與SEQ?ID?NO.4所
5.根據(jù)權利要求1或4所述的環(huán)狀RNA，其特征在于，所述編碼元件包含編碼以下中任意一項的核苷酸序列：狂犬病病毒G蛋白N端截短19個氨基酸、N端截短19個氨基酸/C端截短13個氨基酸、N端截短19個氨基酸/C端截短14個氨基酸、包含突變W33Q、包含突變W33P、包含突變T335Y、包含突變E356F、包含突變E356I、包含突變W33Q/E356I、N端截短19個氨基酸/W33Q/E356I、N端截短19個氨基酸/C端截短13個氨基酸/W33Q/E356I、野生型G蛋白。
6.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)狀RNA，其特征在于，所述編碼元件包含編碼狂犬病G蛋白N端截短19個氨基酸/C端截短13個氨基酸/W33Q/E356I的以下核苷酸序列中任意一項：如SEQID?NO.12所示的核苷酸序列、如SEQ?ID?NO.13所示的核苷酸序列1、如SEQ?ID?NO.14所示的核苷酸序列2、如SEQ?ID?NO.15所示的核苷酸序列3。
7.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)狀RNA，其特征在于，所述環(huán)狀RNA包含如下(a)～(d)中任一項所示排列次序的元件：
8.根據(jù)權利要求7所述的環(huán)狀RNA，其特征在于，所述翻譯起始元件包含如下所示的一種或兩種以上的具有翻譯起始活性的序列：IRES序列、5’UTR序列、Kozak序列、包含m6A修飾的序列、核糖體18S?rRNA的互補序列；所述插入元件包含如下所示的一種或兩種以上的序列：非翻譯區(qū)序列、polyN序列、適配體序列、核糖體開關序列、結合轉錄調控因子的序列；所述polyN序列中，N選自A、T、G、C中的至少一種。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的環(huán)狀RNA，其特征在于，所述編碼元件包含以下中任意一項的核苷酸序列：如SEQ?ID?NO.8所示的核苷酸序列、如SEQ?ID?NO.10所示的核苷酸序列、如SEQ?ID?NO.16所示的核苷酸序列、如SEQ?ID?NO.17所示的核苷酸序列、如SEQ?ID?NO.18所示的核苷酸序列、如SEQ?ID?NO.20所示的核苷酸序列、如SEQ?ID?NO.21所示的核苷酸序列、如SEQ?ID?NO.22所示的核苷酸序列。
10.一種線狀RNA，其特征在于，所述線狀RNA發(fā)生自剪切反應后環(huán)化形成如權利要求1-9中任一項所述的環(huán)狀RNA。
11.一種重組核酸分子，其特征在于，所述重組核酸分子轉錄后形成線狀RNA；所述線狀RNA如權利要求10所示。
12.一種重組大腸桿菌工程菌，其特征在于，所述工程菌為如權利要求11所述的重組核酸分子轉化E.coli而得。
13.一種如權利要求1-9中任一項所述的環(huán)狀RNA，或如權利要求10所述的線狀RNA，或如權利要求11所述的重組核酸分子，或如權利要求12所述的重組大腸桿菌工程菌在制備用于預防和/或治療狂犬病的藥物中的用途。
...【技術特征摘要】
1.一種環(huán)狀rna，其特征在于，所述環(huán)狀rna包含編碼元件，所述編碼元件編碼包含狂犬病病毒g蛋白的多肽。
2.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)狀rna，其特征在于，所述編碼元件編碼狂犬病病毒g蛋白的氨基酸序列包含如seq?id?no.3所示的序列，或與seq?id?no.3所示的序列具有至少90％的序列同一性，且具有或部分具有g蛋白活性的序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的環(huán)狀rna，其特征在于，所述編碼元件編碼包含以下任意一項：狂犬病病毒g蛋白n端截短19個氨基酸、n端截短19個氨基酸/c端截短13個氨基酸、n端截短19個氨基酸/c端截短14個氨基酸、包含突變w33q、包含突變w33p、包含突變t335y、包含突變e356f、包含突變e356i、包含突變w33q/e356i、n端截短19個氨基酸/w33q/e356i、n端截短19個氨基酸/c端截短13個氨基酸/w33q/e356i、野生型g蛋白。
4.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)狀rna，其特征在于，所述編碼元件編碼狂犬病g蛋白的核苷酸序列包含如seq?id?no.4所示的序列，或與seq?id?no.4所示的序列具有至少90％的序列同一性，且編碼具有或部分具有狂犬病g蛋白活性的多肽的序列。
5.根據(jù)權利要求1或4所述的環(huán)狀rna，其特征在于，所述編碼元件包含編碼以下中任意一項的核苷酸序列：狂犬病病毒g蛋白n端截短19個氨基酸、n端截短19個氨基酸/c端截短13個氨基酸、n端截短19個氨基酸/c端截短14個氨基酸、包含突變w33q、包含突變w33p、包含突變t335y、包含突變e356f、包含突變e356i、包含突變w33q/e356i、n端截短19個氨基酸/w33q/e356i、n端截短19個氨基酸/c端截短13個氨基酸/w33q/e356i、野生型g蛋白。
6.根據(jù)權利要求1所述的環(huán)狀rna，其特征在于，所述編碼元件包含編碼狂犬病g蛋白n端截短19個氨基酸/c端截短13個氨基酸/w33q/e356i的以下核苷酸序列中任意一項：如seqid...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：仲從浩，殷波，翟偉鋒，劉純西，左熾健，張震，聶文豪，
申請(專利權)人：上海申銳聯(lián)生物醫(yī)藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。