【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于病毒檢測，尤其涉及基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的lamp引物組、試劑盒及方法。
技術介紹
1、2022年5月7日起，多個歐美國家陸續出現“猴痘”病毒疫情，在多個非猴痘流行的國家發現猴痘病例屬于“非典型”情況。7月23日，世界衛生組織宣布猴痘疫情為“國際關注的突發公共衛生事件”，截至2022年10月19日，全球共累計報告了75141例感染病例，100多個國家發現猴痘病例。猴痘病毒仍然在多國持續擴散，因此，十分有必要擴大猴痘病毒的檢測體系。
2、目前，熒光定量pcr是國內外檢測猴痘病毒的主要檢測方法，其他方法研究較少。且現有的監測猴痘病毒的裝置不便于攜帶，無法適用于機場、車站、?？诘鹊目焖贆z測。因此，急需建立一種快速、靈敏、準確的雙重可視化環介導等溫擴增檢測方法，為應對猴痘疫情提供應急技術儲備。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的lamp引物組、試劑盒及方法，所述lamp引物組靈敏度高，特異性強，所述方法操作簡單、快速，不僅可提高檢測準確度，還可大大降低漏檢率。
2、為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：
3、一方面，本專利技術提供了一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的lamp引物組，所述lamp引物組包括檢測猴痘病毒j2r基因的引物組和檢測猴痘病毒f3l-f4l基因的引物組；
4、所述檢測猴痘病毒j2r基因的引物組包括
5、所述f3引物的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述b3引物的核苷酸序列如seqid?no.2所示，所述fip引物的核苷酸引物如seq?id?no.3所示，所述bip引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，所述loopf引物的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，所述loopb引物的核苷酸引物如seq?id?no.6所示；
6、所述檢測猴痘病毒f3l-f4l基因的引物組包括f3’引物、b3’引物、fip’引物、bip’引物、loopf’引物和loopb’引物；
7、所述f3’引物的核苷酸序列如seq?id?no.7所示，所述b3’引物的核苷酸序列如seqid?no.8所示，所述fip’引物的核苷酸引物如seq?id?no.9所示，所述bip’引物的核苷酸序列如seq?id?no.10所示，所述loopf’引物的核苷酸序列如seq?id?no.11所示，所述loopb’引物的核苷酸引物如seq?id?no.12所示。
8、可選地，所述f3引物、b3引物、fip引物、bip引物、loopf引物和loopb引物的摩爾比為：
9、0.2:0.2:1.2:1.2:0.8:0.8；
10、所述f3’引物、b3’引物、fip’引物、bip’引物、loopf’引物和loopb’引物的摩爾比為：
11、0.2:0.2:1.2:1.2:0.8:0.8。
12、第二方面，本專利技術提供了上述lamp引物組在制備檢測猴痘病毒的試劑盒中的應用。
13、第三方面，本專利技術提供了一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，所述試劑盒中包含上述lamp引物組。
14、可選地，所述試劑盒中還包含bst2.0?dna聚合酶、lamp反應液、陽性對照物和陰性對照物。
15、可選地，所述試劑盒中還包含反應緩沖液、中性紅染色液和pcr增強劑。
16、可選地，所述反應緩沖液中包含如下濃度的組分：8mm的mgso4，10mm的(nh4)2so4，50mm的kcl，0.1％的tween-20，0.7m的甜菜堿，ph調至8.8@25℃。
17、可選地，所述中性紅染色液的摩爾濃度為62.5～250μmol/l。
18、可選地，所述pcr增強劑包括鹽酸胍和牛血清白蛋白。
19、本專利技術中，采用lamp引物組可雙靶標檢測猴痘病毒的f3l-f4l基因和j2r基因，不僅提高了檢測準確度，也可大大降低漏檢率。
20、本專利技術中，在反應前加入了中性紅染色液作為ph指示劑，無需開蓋，減少了氣溶膠污染，反應前后顏色變化明顯，可快速判定檢測結果，操作簡單。
21、本專利技術中，通過添加pcr增強劑可明顯提高lamp反應效率和靈敏度，進而提高試劑盒的檢測效果。
22、第四方面，本專利技術提供了一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的方法，所述方法為采用上述試劑盒對待測樣品的基因組dna進行雙重可視化環介導等溫擴增反應。
23、可選地，所述雙重可視化環介導等溫擴增反應的溫度為64～65℃，所述雙重可視化環介導等溫擴增反應的時間為55～60min。
24、可選地，在所述雙重可視化環介導等溫擴增反應完成后，還包括85℃酶失活10min的步驟。
25、與現有技術相比，本專利技術具有以下有益效果：
26、1)本專利技術提供的lamp引物組，靈敏度高，特異性強。
27、2)本專利技術提供的基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，可雙靶標檢測猴痘病毒的f3l-f4l基因和j2r基因，不僅提高了檢測準確度，也大大降低了漏檢率。
28、3)本專利技術在反應前加入了適量的中性紅ph指示劑染料，無需開蓋，減少了氣溶膠污染，反應前后顏色變化明顯，可快速判定檢測結果，操作簡單。
29、4)本專利技術通過添加pcr增強劑(鹽酸胍、牛血清白蛋白)提高反應效率和檢測靈敏度，使用簡單的方法達到了復雜技術的標準，并實現了準確、高通量的診斷。
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1.一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的LAMP引物組，其特征在于，所述LAMP引物組包括檢測猴痘病毒J2R基因的引物組和檢測猴痘病毒F3L-F4L基因的引物組；
2.根據權利要求1所述的一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的LAMP引物組，其特征在于，所述F3引物、B3引物、FIP引物、BIP引物、LoopF引物和LoopB引物的摩爾比為：
3.權利要求1或2所述的LAMP引物組在制備檢測猴痘病毒的試劑盒中的應用。
4.一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含權利要求1或2所述的LAMP引物組。
5.根據權利要求4所述的一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含Bst2.0?DNA聚合酶、LAMP反應液、陽性對照物和陰性對照物。
6.根據權利要求5所述的一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含反應緩沖液、中性紅染色液和PCR增強劑。
7.根據權利要求6所
8.根據權利要求6所述的一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述中性紅染色液的摩爾濃度為62.5～250μmol/L；
9.一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的方法，其特征在于，所述方法為采用權利要求4～8任意一項所述的試劑盒對待測樣品的基因組DNA進行雙重可視化環介導等溫擴增反應。
10.根據權利要求9所述的一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的方法，其特征在于，所述雙重可視化環介導等溫擴增反應的溫度為64～65℃，所述雙重可視化環介導等溫擴增反應的時間為55～60min；
...【技術特征摘要】
1.一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的lamp引物組，其特征在于，所述lamp引物組包括檢測猴痘病毒j2r基因的引物組和檢測猴痘病毒f3l-f4l基因的引物組；
2.根據權利要求1所述的一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的lamp引物組，其特征在于，所述f3引物、b3引物、fip引物、bip引物、loopf引物和loopb引物的摩爾比為：
3.權利要求1或2所述的lamp引物組在制備檢測猴痘病毒的試劑盒中的應用。
4.一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含權利要求1或2所述的lamp引物組。
5.根據權利要求4所述的一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包含bst2.0?dna聚合酶、lamp反應液、陽性對照物和陰性對照物。
6.根據權利要求5所述的一種基于雙重可視化環介導等溫擴增法檢測猴痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：歐陽松應，王冬梅，周振杰，許淑瑩，張晉碩，
申請(專利權)人：福建師范大學，
類型：發明
國別省市：
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