【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物技術與生物育種領域，具體包括利用黃瓜花葉病毒(cucumbermosaic?virus,cmv)構建遞送crispr的單鏈引導(single?guide?rna,sgrna)載體，在轉cas9植物進行靶標基因的定點編輯，由該載體引起植物基因組dna定點突變可遺傳至后代、且后代中不攜帶cmv。
技術介紹
1、近年來，crispr/cas基因組定點編輯技術出現，為植物功能基因組學研究和作物精準育種開辟了新途徑，在農作物的功能基因組學研究和遺傳改良方面展現出巨大應用前景；目前利用該技術進行基因組定點編輯的植物已超過50種，包括模式植物、農作物、果蔬和花卉等。
2、通過轉基因將crispr/cas編輯組分遞送入植物細胞獲得靶標基因的可遺傳的修飾是目前最為主要的手段，但目前幾乎所有通過植物遺傳轉化獲得可穩定遺傳基因組dna定點突變均依賴于組織培養，而組織培養又存在許多缺點：僅適用于有限物種和基因型、費力耗時、可能導致非預期的性狀改變。一些發育調節因子，如wuschel、baby?boom和growthregulating?factor等轉錄因子，已用于提高組織培養過程中的遺傳轉化與植株再生效率，但這些基因的組成性表達干擾植物的正常發育，并且仍然需要組織培養。因此，急需一種將crispr組分遞送到植物生殖細胞或分生分生組織中以實現不依賴基因型、可以穩定遺傳至下一代的基因定點編輯，無需組織培養或者是減少組培操作的基因編輯遞送技術平臺。
3、病毒具有基因組復制快、蛋白翻譯效率高以及系統性侵染整個植物的特
4、基因編輯組分在植物的分生組織中大量表達是實現可遺傳的基因編輯關鍵限制性因素，將cas9和sgrna遞送至分生組織或卵細胞可獲得比較高的種傳編輯效率，但這僅在擬南芥及其近親物種中取得了成功。通過將可移動的rna元件(ft)或trna融合到sgrna的3'端，在cas9轉基因本氏煙中建立了基于trv可遺傳基因編輯系統，在靶標基因編輯植株的下一代中可獲得65～100％的基因突變的效率，其原理是重組trv攜帶可移動的rna后更有利于進入植物的分生組織。同樣地，在轉cbe或者cas9的擬南芥中，通過trv遞送3'端攜帶ile-trna的sgrna可獲得基因組dna突變的后代。bsmv是一種在小麥中可以種傳的病毒，在病毒基因組γrna中插入靶標基因的sgrna，攜帶sgrna的重組bsmv在本氏煙中繁殖后轉接到轉cas9小麥中，在3個測定小麥品種中，獲得了12.9％～100％基因編輯種傳效率，但編輯后代植株的帶毒率高達100％，這限制bsmv作為sgrna遞送載體進行可遺傳dna定點修飾的實際應用價值。
5、雙子葉植物中，最常用的是通過trv載體遞送sgrna在轉核酸酶的植物進行基因組dna定點突變，但僅僅是在模式植物擬南芥和本氏煙直接獲得可以種傳的基因編輯。目前，多個課題將攜帶靶標基因的sgrna重組trv接種于轉cas9番茄葉片中，可獲得高達～70％體細胞編輯效率，但目的基因定點突變遺傳至下一代則需要通過組織培養才能獲得。最近，美國明尼蘇達大學voytas課題組將攜帶細胞分裂素合成基因(ipt)和靶標sgrna的trv浸潤接種于去除頂端轉cas9番茄植株的腋下區，發現在腋下潛在分生組織中從頭再生出來植株中靶標基因的定點突變可以遺傳至下一代，這是國際上首次在農作物中通過病毒遞送srna在轉cas蛋白植株獲得了可遺傳基因編輯。這種方法主要過程如下：a)攜帶ipt和sgrna的trv通過農桿菌浸潤接種于番茄枝條的腋下區域，b)番茄接種重組trv時候，必須將頂端去除，接種病毒植株先在18℃條件下生長1個月，c)在植株枝條腋下區域從頭再生的芽必須單個剪切下來，并再次單獨種植到土壤中，在28℃條件下生長至果實成熟；整個流程較為繁瑣，使得番茄生育周期變長，并且由于重組trv直接通過農桿菌浸潤接種番茄腋下區，在該區域大量表達了ipt而導致在植株腋下潛在分生組織中從頭再生芽畸形現象較為嚴重，還有再生芽中可能存在來源于病毒t-dna的插入。
6、黃瓜花葉病毒(cucumber?mosaic?virus,cmv)是植物病毒中寄主范圍最廣的、世界性分布的病原物之一，能夠侵染包括單子葉和雙子葉在內1200多種寄主植物，除了本氏煙和擬南芥模式植物，還包括番茄、大豆、玉米、辣椒和棉花等具有重要經濟價值的農作物。cmv是正義單鏈rna，基因組由3條rna分子組成，rna1編碼復制相關的酶1a，rna2編碼rna聚合酶2a和基因沉默抑制子2b，rna3編碼運動蛋白(movement?protein,mp)和外殼蛋白(coatprotein，cp)。目前已將rna2中的2b部分區域缺失構成病毒誘導基因沉默載體以及把cmv的外殼cp缺失改造成不能系統性移動性的外源蛋白表達載體。cmv基因組rna2編碼的2b蛋白是基因沉默抑制子，參與病毒防御植物抗病反應，也是調控cmv侵染寄主植物的分生組織關鍵因子。
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是提供基于黃瓜花葉病毒介導可遺傳的基因編輯載體構建方法及其應用。
2、為了解決上述技術問題，本專利技術提供載體pcb301r3-sgpds的構建方法：在黃瓜花葉病毒(cucumber?mosaic?virus，cmv)基因組rna3的侵染性克隆pcb301r3的cp與3'utr之間區域插入靶標基因的sgrna，獲得pcb301r3-sgpds；所述靶標基因的sgrna為5'
3、-ggactcttgccagcaatgct-3'。pcb301r3-sgpds為基于黃瓜花葉病毒介導可遺傳的基因編輯載體。
4、作為本專利技術的載體pcb301r3-sgpds構建方法的改進，包括以下步驟：
5、1)、人工合成一條5'-3'序列依次為cp序列、含2個bsai酶切位點的20個堿基、bamhi酶切位點、cas9的scaffold序列、stui酶切位點、cmv的3'utr、含saci酶切位點的hdv核酶序列、長度為1155bp的dna序列；所述dna序列為seq?id?no:1；
6、2)、質粒pcb301本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.載體pCB301R3-sgPDS的構建方法，其特征在于：在黃瓜花葉病毒(CMV)基因組RNA3的侵染性克隆pCB301R3的CP與3'UTR之間區域插入靶標基因的sgRNA，獲得pCB301R3-sgPDS；所述靶標基因的sgRNA為5'-ggactcttgccagcaatgct-3'。
2.根據權利要求1所述的載體pCB301R3-sgPDS構建方法，其特征在于包括以下步驟：
3.基于CMV介導可遺傳的基因編輯載體的應用，其特征在于：
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：
5.根據權利要求3或4所述的應用，其特征在于：
6.根據權利要求3～5任一所述的應用，其特征在于：
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：
【技術特征摘要】
1.載體pcb301r3-sgpds的構建方法，其特征在于：在黃瓜花葉病毒(cmv)基因組rna3的侵染性克隆pcb301r3的cp與3'utr之間區域插入靶標基因的sgrna，獲得pcb301r3-sgpds；所述靶標基因的sgrna為5'-ggactcttgccagcaatgct-3'。
2.根據權利要求1所述的載體pcb301r3-...
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