【技術實現步驟摘要】
本申請總體上涉及分析物(例如，靶標)檢測領域，并且具體地涉及使用催化報告分子沉積(card)的檢測方法。
技術介紹
1、對于研究和醫學應用，可能需要檢測單個細胞或組織樣品內的多個生物學相關分子。免疫學方法通常用于此目的。此類方法總體涉及將抗體與樣品中的目標分子結合，生成與抗體相關聯的可檢測信號以使得每個目標分子彼此區分開，以及使用分析方法檢測信號。在此類免疫學方法中已使用催化報告分子沉積(card)來產生與抗體相關聯的增強信號。card的典型工作流程是將靶標分子-特異性抗體施用于樣品，然后施用識別一級抗體的二級抗體。二級抗體連接到酶(例如辣根過氧化物酶(hrp)、堿性磷酸酶)，所述酶將底物轉化為與附近的酚類殘基結合的反應劑(例如酪氨酸)。因為細胞樣品中酚類殘基十分豐富，因此結果是在一級抗體附近有密集標記。
2、card的一個技術問題是難以從樣品中去除二級抗體。當需要使用額外一級抗體來探測相同樣品中的額外目標分子時，就會出現此問題。可以使用加熱或微波來去除二級抗體，但是此方法可損壞樣品，從而降低后續測試的質量。此外，此處理經常是耗時的。
3、因此，一種避免嚴苛的樣品處理并允許在單個樣品中檢測多種目標分子的方法將是有用的card方法學改進。
技術實現思路
1、根據說明書，提供一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，以復用催化報告分子沉積(catalyzed?reporter?deposition，card)并實現更高水平的復用檢測。
2、在一個
3、(1)使正測試一種或多種靶標的存在的樣品與一種或多種靶標特異性結合配偶體接觸，其中每種靶標特異性結合配偶體連接到核酸鏈，并且其中具有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接到不同的核酸鏈；
4、(2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體；
5、(3)使來自步驟(1)或任選地步驟(2)的所述樣品與連接到核酸鏈的酶接觸，所述核酸鏈與連接到所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈互補，其中滿足以下(i)或(ii)或兩者：
6、(i)所述核酸鏈使用第一可釋放接頭來連接到所述靶標特異性結合配偶體；并且
7、(ii)所述酶使用第二可釋放接頭來連接到所述互補核酸鏈；
8、(4)任選地去除連接到互補核酸鏈的未結合的酶；
9、(5)使來自步驟(3)或任選地步驟(4)的所述樣品與包含可檢測地標記的底物的底物綴合物接觸，其中所述底物和所述可檢測標記任選地使用第三可釋放接頭來連接；
10、(6)任選地去除未結合的底物綴合物；
11、(7)任選地釋放所述結合的酶；
12、(8)任選地對所述樣品進行成像以檢測所述結合的可檢測標記；以及
13、(9)任選地重復步驟(1)-(8)或其任何子集，并且任選地如果使用多于一種靶標特異性結合配偶體，則在成像的步驟(8)之前重復步驟(1)-(7)或其任何子集。
14、在一些實施方案中，所述方法還包括在成像的步驟(8)之前重復步驟(3)-(7)。
15、在一些實施方案中，在步驟(5)中，使包含所述可檢測地標記的底物的所述底物綴合物與所述酶反應以形成活化的底物綴合物，并且所述活化的底物綴合物與所述活化的底物綴合物的受體結合。此外，所述活化的底物綴合物的所述受體可以存在于所述樣品中，其固定化在固體支撐物上，從而導致所述可檢測標記沉積。
16、在另一個實施方案中，所述方法還可包括(10)在步驟(8)之后通過釋放所述第三可釋放接頭來任選地釋放所述結合的可檢測標記，并且任選地重復步驟(1)-(10)或其任何子集。
17、在一些實施方案中，所述方法還可包括擴增連接到步驟(1)的所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈或其一部分。在一些實施方案中，所述擴增步驟在步驟(3)之前進行。
18、在一些實施方案中，一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法包括：
19、(1)使正測試一種或多種靶標的存在的樣品與一種或多種靶標特異性結合配偶體接觸，其中每種靶標特異性結合配偶體連接到核酸鏈，并且其中具有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接到不同的核酸鏈；
20、(2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體；
21、(3)使來自步驟(1)或任選地步驟(2)的所述樣品與連接到核酸鏈的結合對的第一成員接觸，所述核酸鏈與連接到所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈互補，其中滿足以下(i)或(ii)或兩者：
22、(i)所述核酸鏈使用第一可釋放接頭來連接到所述靶標特異性結合配偶體；并且
23、(ii)所述結合對的所述第一成員使用第二可釋放接頭來連接到所述互補核酸鏈；
24、(4)任選地去除連接到互補核酸鏈的結合對的未結合的第一成員；
25、(5)使來自步驟(3)或任選地步驟(4)的所述樣品與任選地使用第三可釋放接頭來連接到酶的所述結合對的第二成員接觸，并任選地去除連接到所述酶的所述結合對的未結合的第二成員；
26、(6)使來自步驟(5)的所述樣品與包含標記的底物的底物綴合物接觸，其中所述底物和所述標記任選地使用第四可釋放接頭來連接；
27、(7)任選地去除未結合的底物綴合物；
28、(8)任選地釋放所述結合對的所述結合的第一成員或第二成員；
29、(9)任選地對所述樣品進行成像以檢測所述結合的可檢測標記；以及
30、(10)任選地重復步驟(1)-(9)或其任何子集，并且任選地如果使用多于一種靶標特異性結合配偶體，則在成像的步驟(9)之前重復步驟(1)-(8)或其任何子集。
31、在一些實施方案中，所述方法還可包括(11)在步驟(9)之后通過裂解所述標記與所述底物之間的所述第三可釋放接頭來任選地釋放所述結合的可檢測標記，并且任選地重復步驟(1)-(11)或其任何子集。
32、在一些實施方案中，所述方法還可包括擴增連接到步驟(1)的所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈或其一部分。在一些實施方案中，所述擴增步驟在步驟(3)之前進行。
33、在一些實施方案中，一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法包括：
34、(1)使正測試一種或多種靶標的存在的樣品與一種或多種靶標特異性結合配偶體接觸，其中每種靶標特異性結合配偶體連接到核酸鏈，并且其中具有不同特異性的靶標特異性結合配偶體連接到不同的核酸鏈；
35、(2)任選地去除未結合的靶標特異性結合配偶體；
36、(3)使來自步驟(1)或任選地步驟(2)的所述樣品與連接到核酸鏈的酶接觸，所述核酸鏈與連接到所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈互補，其中滿足以下(i)或(ii)或兩者：
37、(i)所述核酸鏈使用第一可釋放接頭來連接到所述靶標特異性結合配偶體；并本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
2.如權利要求1所述的方法，其中所述中間部分的第二區域包含重復序列，每個所述序列都直接或間接地與連接到所述酶的所述核酸鏈的對應序列特異性結合。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括通過核酸擴增反應來擴增與連接到步驟(1)的所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈結合的所述中間部分，以形成重復序列的擴增子，每個所述序列都直接或間接地與連接到所述酶的所述核酸鏈的對應序列特異性結合。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述核酸擴增反應包括基于發夾的串聯聚合反應或基于發夾的樹突聚合反應，任選地所述擴增反應是引物交換反應。
5.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
6.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
7.如權利要求6所述的方法，其還包括(11)在步驟(9)之后通過裂解所述標記與所述底物之間的所述可釋放接頭來任選地釋放所述結合的可檢測標記，并且任選地重復步驟(1)-(9)和(11)中的任一者。
8.一種用
9.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，所述方法包括：
10.如權利要求1所述的方法，其中所述酶使用酶失活劑來使其失活，其中所述酶失活劑包括二硫蘇糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、還原型谷胱甘肽、過氧化物、氰化物、氟化物或疊氮化物。
11.如權利要求1所述的方法，其中使所述結合的酶失活的步驟(4)進行少于20分鐘。
12.如權利要求1所述的方法，其中使所述結合的酶失活的步驟(4)進行少于10分鐘。
13.如權利要求1所述的方法，其中使所述結合的酶失活的步驟(4)進行少于2分鐘。
14.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
15.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(3)中，包含所述可檢測地標記的底物的所述底物綴合物與所述酶反應以形成活化的底物綴合物，并且所述活化的底物綴合物與所述活化的底物綴合物的受體結合。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述活化的底物綴合物的所述受體存在于所述樣品中，從而導致所述可檢測標記沉積。
17.如權利要求5所述的方法，其還包括(10)在步驟(8)之后通過釋放所述第三可釋放接頭來任選地釋放所述結合的可檢測標記，并且任選地重復步驟(1)-(10)或其任何子集。
18.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
19.如權利要求18所述的方法，其還包括(11)在步驟(9)之后通過裂解所述標記與所述底物之間的所述第三可釋放接頭來任選地釋放所述結合的可檢測標記，并且任選地重復步驟(1)-(11)或其任何子集。
20.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
21.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
22.如權利要求9所述的方法，其中在步驟(5)之后，將所述酚部分酶促地轉化為活化態，從而導致所述標記沉積。
23.如權利要求1所述的方法，其中所述結合的標記使用可釋放接頭或不使用可釋放接頭來釋放。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述結合的標記通過裂解所述標記與所述底物之間的所述可釋放接頭或通過裂解所述底物與所述核酸之間的所述可釋放接頭來釋放。
25.如權利要求8所述的方法，其中所述結合的標記通過使與來自步驟(5)的所述核酸鏈結合的來自步驟(8)的所述核酸鏈去雜化來釋放。
26.如權利要求5所述的方法，其中所述方法還包括擴增連接到步驟(1)的所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈或其一部分，任選地其中所述擴增步驟在步驟(3)之前進行。
27.如權利要求8所述的方法，其中所述方法還包括擴增步驟(5)的所述核酸鏈結合的底物的所述核酸鏈或其一部分，任選地其中所述擴增步驟在步驟(5)或任選的步驟(6)或任選的步驟(7)之后進行。
28.如權利要求8所述的方法，其中所述方法還包括：首先擴增連接到步驟(1)的所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈或其一部分，任選地其中所述擴增步驟在步驟(3)之前進行；以及其次擴增步驟(5)的所述核酸鏈結合的底物的所述核酸鏈或其一部分，任選地其中所述第二擴增步驟在步驟(5)或任選的步驟(6)或任選的步驟(7)之后進行。
29.如權利要求1所述的方法，其中所述可釋放接頭包括二硫鍵、酯、鄰二醇、砜和可光裂解接頭中的至少一者。
<...【技術特征摘要】
1.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
2.如權利要求1所述的方法，其中所述中間部分的第二區域包含重復序列，每個所述序列都直接或間接地與連接到所述酶的所述核酸鏈的對應序列特異性結合。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述方法還包括通過核酸擴增反應來擴增與連接到步驟(1)的所述靶標特異性結合配偶體的所述核酸鏈結合的所述中間部分，以形成重復序列的擴增子，每個所述序列都直接或間接地與連接到所述酶的所述核酸鏈的對應序列特異性結合。
4.如權利要求3所述的方法，其中所述核酸擴增反應包括基于發夾的串聯聚合反應或基于發夾的樹突聚合反應，任選地所述擴增反應是引物交換反應。
5.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
6.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
7.如權利要求6所述的方法，其還包括(11)在步驟(9)之后通過裂解所述標記與所述底物之間的所述可釋放接頭來任選地釋放所述結合的可檢測標記，并且任選地重復步驟(1)-(9)和(11)中的任一者。
8.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
9.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，所述方法包括：
10.如權利要求1所述的方法，其中所述酶使用酶失活劑來使其失活，其中所述酶失活劑包括二硫蘇糖醇(dtt)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、還原型谷胱甘肽、過氧化物、氰化物、氟化物或疊氮化物。
11.如權利要求1所述的方法，其中使所述結合的酶失活的步驟(4)進行少于20分鐘。
12.如權利要求1所述的方法，其中使所述結合的酶失活的步驟(4)進行少于10分鐘。
13.如權利要求1所述的方法，其中使所述結合的酶失活的步驟(4)進行少于2分鐘。
14.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
15.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(3)中，包含所述可檢測地標記的底物的所述底物綴合物與所述酶反應以形成活化的底物綴合物，并且所述活化的底物綴合物與所述活化的底物綴合物的受體結合。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述活化的底物綴合物的所述受體存在于所述樣品中，從而導致所述可檢測標記沉積。
17.如權利要求5所述的方法，其還包括(10)在步驟(8)之后通過釋放所述第三可釋放接頭來任選地釋放所述結合的可檢測標記，并且任選地重復步驟(1)-(10)或其任何子集。
18.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
19.如權利要求18所述的方法，其還包括(11)在步驟(9)之后通過裂解所述標記與所述底物之間的所述第三可釋放接頭來任選地釋放所述結合的可檢測標記，并且任選地重復步驟(1)-(11)或其任何子集。
20.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
21.一種用于測試樣品中一種或多種靶標的存在的方法，其包括：
22.如權利要求9所述的方法，其中在步驟(5)之后，將所述酚部分酶促地轉化為活化態，從而導致所述標記沉積。
23.如權利要求1所述的方法，其中所述結合的標記...
【專利技術屬性】
技術研發人員：M·博布羅，S·亨內克，M·馬內斯，
申請(專利權)人：烏爾蒂維尤股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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