【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學，具體涉及一種志賀氏菌效應蛋白在調控腸道致病力中的應用。
技術介紹
1、志賀氏菌是引起感染性腹瀉疾病的主要原因之一，其特點是攜帶一個編碼大多數毒力基因的大質粒，包括iii型分泌系統(t3ss)。t3ss效應物是支持許多臨床重要革蘭氏陰性病原體感染策略的關鍵毒力因子。效應蛋白是由病原菌分泌的一類外泌型蛋白分子，對于細菌與宿主的緊密結合、宿主細胞膜的穿透以及宿主胞內生存等重要階段具有決定性意義。t3ss小分子特異性抑制劑具有一些優于傳統抗生素的獨特功能，有望開發成為控制病原菌的新型藥物，并且能夠有效遏制耐藥性的產生。
2、了解t3ss介導的發病機制的主要方法是一次確定一種效應物的應用，目的是將個體功能拼湊在一起并揭示感染機制。基于此，通過了解革蘭氏陰性桿菌志賀氏菌的致病機制、鑒定志賀氏菌毒性效應蛋白，從而為了解t3ss介導的發病機制提供新思路，為新藥物的開發提供理論支持。
技術實現思路
1、本專利技術篩選鑒定出了志賀氏菌感染侵襲上皮細胞的關鍵毒性效應蛋白，即本專利技術所述的病原菌致病因子。具體地，所述病原菌致病因子為志賀氏菌效應蛋白ipaj，所述效應蛋白ipaj的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
2、本專利技術通過試驗揭示，所述效應蛋白ipaj及其編碼基因在志賀氏菌感染侵襲上皮細胞過程中發揮毒性功能。志賀氏菌效應蛋白ipaj編碼基因的核苷酸序列具有如seq?idno.2所示的開放閱讀框。
3、進一步地，本專利技術提供所
4、本專利技術采用正向篩選的方法獲得一種志賀氏菌效應蛋白ipaj基因，所述ipaj基因編碼志賀氏菌效應蛋白ipaj，核苷酸序列具有如seq?id?no.2所示的開放閱讀框，所述效應蛋白ipaj的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
5、進一步地，本專利技術提供所述的志賀氏菌效應蛋白ipaj基因在腸道致病中的應用。
6、本領域普通技術人員結合現有技術，通過所述ipaj基因敲除，減弱志賀氏菌的致病能力。
7、為理解病原菌致病因子在腸道致病過程中的應用，本專利技術還提供了一種志賀氏菌基因敲除的方法。該方法是通過λ-red同源重組的基因編輯方式將志賀氏菌效應蛋白ipaj基因敲除，得到敲除所述效應蛋白ipaj基因的突變型菌株，所述ipaj基因敲除片段的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
8、進一步地，作為志賀氏菌基因敲除的實施方法，所述方法包括構建志賀氏菌效應蛋白ipaj基因敲除所需的打靶片段，將其電轉轉入含有psim17質粒的野生型志賀氏菌，利用λ-red同源重組的基因敲除方式得到所述效應蛋白ipaj基因的突變型志賀氏菌菌株。
9、基于本專利技術的記載，本專利技術還請求保護一種敲除所需的打靶片段，其將志賀氏菌效應蛋白ipaj基因換成氯霉素抗性基因盒子，前端是效應蛋白ipaj基因上游1000bp，中間是編碼氯霉素抗性基因的序列，后端是效應蛋白ipaj基因下游1000bp，所述ipaj基因敲除所需的打靶片段的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
10、為了完整無異議地理解本專利技術的技術方案，需要補充說明的是，本專利技術所述志賀氏菌效應蛋白用非傾斜字體“ipaj”表示，志賀氏菌效應蛋白基因用傾斜字體“ipaj”表示。當然，本領域普通技術人員可以根據本專利技術的記載，可以清楚、完整地理解相關基因及其編碼蛋白的含義與表述。
11、與現有技術相比，本專利技術的有益效果在于：
12、1.本專利技術揭示志賀氏菌效應蛋白ipaj在志賀氏菌感染侵襲上皮細胞中發揮毒性功能，是一種志賀氏菌關鍵毒性效應蛋白。所述效應蛋白ipaj具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。本專利技術通過解析其致病機理，為利用病原菌致病因子開發t3ss小分子抑制劑奠定理論基礎，對開發病原菌的新型藥物，遏制耐藥性的產生具有重要意義。
13、2.本專利技術利用瞬時過表達的方法分析效應蛋白ipaj基因，所述ipaj基因能夠在293t細胞中引起細胞死亡；采用λ-red同源重組的基因敲除方式敲除ipaj基因，確定ipaj在志賀氏菌與上皮細胞感染侵襲過程中發揮重要功能。
14、3.本專利技術在研制t3ss小分子特異性抑制劑方面意義重大，借助基因工程技術，通過志賀氏菌效應蛋白ipaj基因敲除，減弱志賀氏菌的腸道致病能力，本專利技術從分子生物學角度為開發控制病原菌的新型藥物提供新的解決思路。
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1.一種病原菌致病因子，其特征在于：
2.根據權利要求1所述的病原菌致病因子，其特征在于：
3.一種根據權利要求1所述的病原菌致病因子在減弱志賀氏菌腸道致病中的應用。
4.根據權利要求書3所述的應用，其特征在于：
5.一種志賀氏菌效應蛋白IpaJ基因，其特征在于：
6.一種減弱志賀氏菌致病能力的方法，其特征在于：
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：
8.一種效應蛋白IpaJ基因敲除所需的打靶片段，其特征在于：
【技術特征摘要】
1.一種病原菌致病因子，其特征在于：
2.根據權利要求1所述的病原菌致病因子，其特征在于：
3.一種根據權利要求1所述的病原菌致病因子在減弱志賀氏菌腸道致病中的應用。
4.根據權利要求書3所述的應用，其特征在于：
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