【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及組織工程，具體涉及一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備及在骨組織再生中的應用。
技術介紹
1、組織工程技術在骨再生方面的研究近年來取得了顯著的進展。首先，從生物材料角度：骨組織工程常用的生物材料包括天然材料和合成材料。天然材料如膠原蛋白、殼聚糖等具有良好的生物相容性和生物降解性；合成材料如聚乳酸、聚乙醇酸等則可以通過調(diào)整化學結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)來滿足不同的需求。此外，復合材料的研究也備受關注，將不同材料的優(yōu)勢結(jié)合起來，以進一步提高骨再生的效果。其次，干細胞在骨再生中具有重要作用。間充質(zhì)干細胞(mscs)是目前研究最多的干細胞類型之一，可以分化為成骨細胞、軟骨細胞等。通過提取患者自身的mscs，在體外擴增并與生物材料結(jié)合，然后移植到骨缺損部位，能夠促進骨組織的再生。很多生長因子也被證實對于骨再生存在促進作用：如生長因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)、成纖維細胞生長因子(fgf)等可以調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和遷移，對骨再生起到關鍵作用。將生長因子與生物材料結(jié)合，或者通過基因工程技術使細胞表達生長因子，能夠增強骨再生的效果。
2、組織工程技術在骨再生領域的臨床應用不斷增加。一些研究已經(jīng)取得了令人鼓舞的結(jié)果，例如使用組織工程骨修復顱骨、頜骨等部位的缺損。然而，目前的臨床應用還面臨一些挑戰(zhàn)，如細胞來源、生物材料的安全性和有效性等問題，需要進一步的研究和驗證。
3、骨再生是一個復雜的過程，需要多學科的合作，包括生物學、醫(yī)學、材料科學、工程學等。不同領域的專家共同研究和開發(fā)新的技術和方法，將有助于推動骨再生
4、干細胞的使用存在一定的倫理問題及細胞來源不足的問題，近年來科學研究發(fā)現(xiàn)提取自功能干細胞的外泌體可以起到類似的促進組織再生的功效。因此，結(jié)合外泌體與仿生材料為組織工程骨再生提供了一個新的思路。
技術實現(xiàn)思路
1、外泌體由于其具有低免疫原性、易于獲取和儲存、安全性高等多項優(yōu)勢，在組織再生領域展現(xiàn)出巨大潛力。
2、基于上述背景及技術優(yōu)勢，本專利技術目的在于采用人源間充質(zhì)干細胞來源的外泌體，與膜性材料結(jié)合制備一種可穩(wěn)定釋放外泌體，發(fā)揮外泌體良好的穩(wěn)定性與低免疫源性，實現(xiàn)精準地促進局部骨再生的效果。實現(xiàn)缺損的修復與功能重建。
3、本專利技術采用如下技術方案：
4、一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，包括以下步驟：
5、s1、人源間充質(zhì)干細胞的外泌體提取：獲取人源間充質(zhì)干細胞的來源組織，細胞分離培養(yǎng)后對其增殖能力、表面標記物及多向分化能力進行鑒定，最后提取并鑒定人間充質(zhì)干細胞來源的外泌體；
6、s2、plla/明膠復合纖維膜的制備：將不同比例plla和明膠溶于共溶劑三氟乙醇，通過靜電紡絲制備復合纖維，采用接收器進行紡絲得到無紡和平行排布的纖維膜，所述接收器為金屬平板和滾筒中的一種；
7、s3、將外泌體負載于plla/明膠復合纖維膜表面。
8、作為本專利技術進一步的技術方案，人源間充質(zhì)干細胞的來源組織包括骨髓、脂肪、臍帶、牙周膜和牙髓。
9、作為本專利技術進一步的技術方案，所述人源間充質(zhì)干細胞的外泌體提取包括人牙周膜干細胞pdlsc的提取鑒定和pdlsc的外泌體提取。
10、作為本專利技術進一步的技術方案，所述人牙周膜干細胞pdlsc的提取鑒定包括以下步驟：
11、獲取正畸減數(shù)拔牙牙齒的牙周膜，無菌條件下將組織剪碎，0.2％i型膠原酶37℃消化45min，消化后的細胞懸浮于含20％血清的α-mem培養(yǎng)基中，接種在t25培養(yǎng)瓶中，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞匯合后用0.1％胰蛋白酶/0.1％edta溶液消化傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)3-5代的細胞凍存于液氮中備用，采用流式細胞分析對干細胞進行鑒定，對細胞表面標記物cd105、cd90、cd146、cd34及細胞純度進行分析，cck-8及克隆形成效率實驗檢測干細胞的增殖能力，分別采用成骨、成脂肪、成軟骨等誘導培養(yǎng)基對干細胞進行誘導分化培養(yǎng)，2-3周后分別進行茜素紅、油紅o、阿利新藍等染色，檢測干細胞是否具有分化潛能，所述分化潛能包括成骨、成脂肪及成軟骨。
12、作為本專利技術進一步的技術方案，所述pdlsc的外泌體提取包括以下步驟：
13、提取外泌體前兩天，將誘導培養(yǎng)基更換為無外泌體血清培養(yǎng)基，分別采用試劑盒法和梯度離心法提取外泌體，收集細胞培養(yǎng)上清液4℃，300×g離心10min去除細胞雜質(zhì)，4℃，1000×g離心15min和10,000×g離心30min，超速離心機4℃，100,000×g離心2h，將離心所得外泌體重懸于適量pbs中，得到外泌體懸液，以備進一步使用；提取外泌體總蛋白，并進行定量鑒定；取適量外泌體懸液進行透射電鏡觀察。
14、作為本專利技術進一步的技術方案，所述plla/明膠復合纖維膜的制備包括以下步驟：
15、將聚左旋乳酸(分子量為100,000)溶于三氟乙醇，在常溫下磁力攪拌24小時，得到濃度為0.1g/ml的聚合物溶液a；將明膠(凍力值為250gbloom)溶于三氟乙醇，在常溫下磁力攪24小時，得到濃度為0.1g/ml的聚合物溶液b；將聚合物溶液a與聚合物溶液b以體積比1:1的比例進行混合，在常溫下磁力攪拌4小時混合均勻，得到聚合物溶液c；
16、將所述聚合物溶液c裝入無菌注射器中，將注射器固定在恒流泵上，以不銹鋼滾筒為接收器進行靜電紡絲，滾筒轉(zhuǎn)速為400rpm，電壓為15kv，接收距離為15cm擠出速度為0.8ml/h，連續(xù)紡絲10小時，得到纖維無規(guī)排布的復合纖維膜；將復合纖維膜置于真空干燥箱中，恒溫37℃，真空度30pa下干燥24小時，將干燥后的復合纖維膜置于1,3-二甲氨基丙基-3-乙基二亞胺/n-羥基琥珀酰亞胺的90％乙醇溶液中，在4℃條件下交聯(lián)處理24小時，隨后冷凍干燥24小時，得到交聯(lián)的復合纖維膜，即plla/明膠復合纖維膜，其形貌sem圖如圖2所示。
17、作為本專利技術進一步的技術方案，所述1,3-二甲氨基丙基-3-乙基二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的總濃度為0.02g/ml，1,3-二甲氨基丙基-3-乙基二亞胺與n-羥基琥珀酰亞胺的質(zhì)量比為2.5:1。
18、作為本專利技術進一步的技術方案，將外泌體負載于plla/明膠復合纖維膜表面的步驟包括：步驟s2制備的plla/明膠復合纖維膜放置于外泌體懸液中過夜，負載濃度為每mg材料負載45ug外泌體。
19、作為本專利技術進一步的技術方案，還包括以下步驟：
20、參照步驟s2制作好的plla/明膠復合纖維膜厚，將干燥后的plla/明膠復合纖維膜在室溫下，以12kv極化電壓電暈極化處理30分鐘得到電極化的plla/明膠復合纖維膜(plla/gel-p)，再進行同樣濃度的外泌體負載。
21、本專利技術的另本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，人源間充質(zhì)干細胞的來源組織包括骨髓、脂肪、臍帶、牙周膜和牙髓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述人源間充質(zhì)干細胞的外泌體提取包括人牙周膜干細胞PDLSC的提取鑒定和PDLSC的外泌體提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述人牙周膜干細胞PDLSC的提取鑒定包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述PDLSC的外泌體提取包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述PLLA/明膠復合纖維膜的制備包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述1,3-二甲氨基丙基-3-
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，將外泌體負載于PLLA/明膠復合纖維膜表面的步驟包括：步驟S2制備的PLLA/明膠復合纖維膜放置于外泌體懸液中過夜，負載濃度為每mg材料負載45ug外泌體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，還包括以下步驟：
10.一種如1～9任一項權(quán)利要求所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備的PLLA/明膠復合纖維膜在促進骨組織再生中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，人源間充質(zhì)干細胞的來源組織包括骨髓、脂肪、臍帶、牙周膜和牙髓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述人源間充質(zhì)干細胞的外泌體提取包括人牙周膜干細胞pdlsc的提取鑒定和pdlsc的外泌體提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述人牙周膜干細胞pdlsc的提取鑒定包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述pdlsc的外泌體提取包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種促進骨再生的外泌體與靜電紡絲復合材料的制備，其特征在于，所述p...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：李婧，曹聰，蔡晴，徐靜晨，郭燕寧，王玥，劉敬一，喻盈捷，汲偉，王玉清，
申請(專利權(quán))人：中日友好醫(yī)院中日友好臨床醫(yī)學研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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