【技術實現步驟摘要】
本公開涉及一種純化融合蛋白的方法，所述蛋白例如是包含pd-1結合結構域和細胞因子的融合蛋白。
技術介紹
1、抗體能夠識別特定表位，具有良好的靶向性。免疫細胞因子具有包括免疫調節、細胞生長調控在內的多種作用。將細胞因子與抗體融合表達所得融合蛋白，兼具靶向性與免疫調節作用，在腫瘤治療、免疫調節等多個領域展現出了優于抗體的治療效果，在生物醫藥產業具有廣闊的應用前景。與抗體相比，抗體-細胞因子融合蛋白穩定性較差，培養產物中通常含有同源二聚體、降解碎片等多種產品相關雜質，對純化工藝的設計帶來很大的挑戰。如何優化純化工藝，有效去除產品相關雜質，提高目標分子的純度是目前工業化生產中重要的問題。
2、knob?into?hole(kih)是一種廣泛使用的fc結構改造技術，可用于促進異源重鏈的裝配，降低同源重鏈錯誤裝配的比例，但無法徹底避免同源二聚體的形成。為解決此問題，研究人員開發了多種解決方案，如在重鏈之間引入工程化二硫鍵、優化重鏈組裝界面的電荷分布等，顯著降低了表達產物中同源二聚體的比例，但仍無法徹底解決。基于kih模型的抗體或抗體融合蛋白中存在同源二聚體、聚體、降解碎片等雜質。同源二聚體與目標分子理化性質差異較小，去除難度較大。專利cn115066258a公開了一種去除雙特異性抗體同源二聚體的方法，其利用同源二聚體、目標分子與κselect親和層析填料結合力差異，去除同源二聚體，但此種方案中輕鏈必須為不同亞型，且κselect親和層析填料使用成本較高。另文獻報道，可使用復合陽離子層析填料(如capto?mmc?impres)去
3、目前現有技術中未披露基于通用型pro?a親和層析有效去除同源二聚體的方法。
技術實現思路
1、本公開涉及一種純化融合蛋白(例如抗體與細胞因子的融合蛋白)的方法，有效抑制了純化過程中蛋白分子的不穩定狀態，并對工藝相關雜質進行了有效地去除，特別是有效降低了融合蛋白中同源二聚體的含量。
2、本公開提供一種純化蛋白(例如融合蛋白)的方法，該方法包括以下步驟：
3、(a)上樣步驟：將包含融合蛋白的樣品加載到親和層析填料上；
4、(b)平衡步驟：用平衡緩沖液對上樣后的親和層析填料進行沖洗；
5、(c)淋洗步驟：用淋洗緩沖液對親和層析填料進行淋洗；
6、(d)洗脫步驟：用洗脫緩沖液從親和層析填料上洗脫下融合蛋白，收集洗脫液；
7、在一些實施方案中，所述融合蛋白的等電點(pi)為約4.0至約7.5，例如等電點為約4.5至約7.5、約5.0至約7.5、約5.0至約7.0、約5.5至約7.0、約6.0至約7.0、約6.5至約7.0、約6.0至約6.8、約6.5至約6.8，或者為這些點值之間的任意范圍。在一些實施方案中，所述融合蛋白是一種低等電點抗體。例如，所述融合蛋白的等電點低于7.0，例如等電點為約6.0至約7.0、約6.5至約7.0、約5.7至約6.8、約6.5至約6.8，或者為這些點值之間的任意范圍。在一些實施方案中，所述融合蛋白的等電點為約4.0，約4.5，約5.0，約5.5，約6.0，約6.1，約6.2，約6.3，約6.4，約6.5，約6.6，約6.7，約6.8，約6.9，約7.0。
8、在一些實施方案中，所述融合蛋白是能被親和層析柱層析的蛋白，例如抗體或含有抗體fc的融合蛋白。在一些實施方案中，所述融合蛋白是包含pd-1結合結構域、細胞因子和抗體fc的融合蛋白，其中，所述細胞因子選自il-2或其變體。
9、在一些實施方案中，所述pd-1結合結構域位于fc的n端，所述細胞因子位于fc的n端或c端。在一些實施方案中，所述pd-1結合結構域位于fc的n端，所述細胞因子位于fc的c端。
10、在一些實施方案中，所述融合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈。在一些實施方案中，所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈之間的等電點相差不高于(≤)約3.0個單位，例如，約1.0至約3.0單位、約0.5至約3.0單位、約0.5至約1.5單位、約0.5至約2.0單位、約0.5至約2.5單位、約1.0至約1.5單位、約1.0至約2.0單位、約1.0至約2.5單位。例如，約2.8個單位、約2.5個單位、約2.3個單位、約2.2個單位、約2.0個單位、約1.9個單位、約1.7個單位、約1.5個單位、約1.3個單位、約1.2個單位、約1.1個單位、約1.0個單位、約0.8個單位、約0.5個單位。在一些實施方案中，所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈之間的等電點相差不高于約3.0個單位。例如，不高于約2.0個單位，或1.0個單位。在一些實施方案中，所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈之間的等電點相差不高于約1.0個單位。
11、在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液ph為約3.8至約5.0，例如，約3.5至約4.7，約3.5至約4.8，約3.8至約4.5，約4.0至約4.5，約4.1至約4.3，或者為這些點值之間的任意范圍。在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液ph為約3.8，約3.9，約4.0，約4.1，約4.2，約4.3，約4.4，約4.5。
12、在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液中的緩沖物質選自醋酸鈉、檸檬酸鈉、tris、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸、檸檬酸、磷酸中的一種或多種。在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液中的緩沖物質選自醋酸-醋酸鈉、檸檬酸鈉-檸檬酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、或tris和磷酸氫二鈉-檸檬酸。在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液中的緩沖物質為醋酸-醋酸鈉。
13、在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液中的緩沖物質的濃度為約0.03至約0.1mol/l，例如，約0.03至約0.08mol/l，約0.03至約0.07mol/l，約0.04至約0.08mol/l，約0.04至約0.07mol/l，約0.04至約0.06mol/l，或者為這些點值之間的任意范圍。在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液中的緩沖物質的濃度為約0.03mol/l，約0.04mol/l，約0.05mol/l，約0.06mol/l，約0.07mol/l，約0.08mol/l，約0.09mol/l，約0.1mol/l。在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液中的緩沖物質的濃度為約0.05mol/l。
14、在一些實施方案中，所述第一淋洗緩沖液還包含無機鹽，所述無機鹽選自氯化鈉、本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種純化融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述融合蛋白是包含抗體Fc的融合蛋白；優選地，所述融合蛋白是包含PD-1結合結構域、細胞因子和抗體Fc的融合蛋白，其中，所述細胞因子選自IL-2或其變體；
3.根據權利要求1-2任一項所述的方法，其中：
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述第一淋洗緩沖液、第二淋洗緩沖液和第三淋洗緩沖液中的緩沖物質分別獨立地選自醋酸鈉、檸檬酸鈉、Tris、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸、檸檬酸、磷酸中的一種或多種；
5.根據權利要求3-4任一項所述的方法，其中，所述(c)淋洗步驟包括：
6.一種純化融合蛋白的方法，其包括如下步驟：
7.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中，所述融合蛋白包含PD-1結合結構域和細胞因子；
8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述細胞因子為IL-2或其變體；優選地，所述IL-2變體含有如下突變：
9.如權利要求1-8任一項所述的方法，其中，所述融合蛋白還包含免疫球蛋白Fc區；優選地，
10.如權利要求9所述的方法，其中，所述Fc區包含促進Fc區的第一和第二亞基聯合的突變；
...【技術特征摘要】
1.一種純化融合蛋白的方法，該方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述融合蛋白是包含抗體fc的融合蛋白；優選地，所述融合蛋白是包含pd-1結合結構域、細胞因子和抗體fc的融合蛋白，其中，所述細胞因子選自il-2或其變體；
3.根據權利要求1-2任一項所述的方法，其中：
4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述第一淋洗緩沖液、第二淋洗緩沖液和第三淋洗緩沖液中的緩沖物質分別獨立地選自醋酸鈉、檸檬酸鈉、tris、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸、檸檬酸、磷酸中的一種或多種；
5.根據權利要求3-4任一項所述的方...
【專利技術屬性】
技術研發人員：常甜甜，陳偉峰，李磊，
申請(專利權)人：上海邁晉生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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