【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及抗體藥物領域，尤其涉及一種偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法。
技術介紹
1、抗體(antibody)是指機體由于抗原的刺激而產生的具有保護作用的蛋白質，目前抗體在多種疾病的治療領域正發揮著舉足輕重的作用。但是天然的單抗只有一個抗原結合片段(antigen-binding?fragment，fab)，即只有單一的抗原結合表位，限制了其在疾病治療中發揮的作用。因此能夠同時特異性結合兩種抗原分子或同一抗原兩個不同表位的雙特異性抗體(bispecific?antibody，bsab)具有了單抗無法比擬的優勢。目前，雙特異性抗體在逐步成為一類新的治療性抗體，并產生優于單個抗體作用的加成或協同作用。
2、抗體偶聯藥物(antibody-drug?conjugates，adc)是一類由抗體、接頭和細胞毒性有效載荷組成的靶向生物藥劑，結合了抗體的靶點選擇性和高細胞毒性藥物的殺傷力，素有“生物導彈”之稱，是發展最快的癌癥治療方式之一。同時由于adc能夠協同發揮“特異性”靶向作用和對癌細胞“高效”殺傷作用，此類藥物就像精確制導的“生物導彈”，能夠準確摧毀癌細胞，提高治療窗口，減少脫靶副作用。
3、雙抗技術的發展同時也給adc藥物帶來新的思路，通過設計一個雙抗adc(bispecific?adc，bsadc)，一個fab片段與腫瘤細胞相關抗原結合，另一個fab片段用于促進分子的內吞和降解，這樣就能使那些內化作用較弱的腫瘤靶點得到更充分的利用。目前已經有10款雙抗adc進入了臨床階段，其中大部分雙抗
4、綜上所述，如何提高雙特異性抗體制備獲得adc產品時的產品均質性，已成為目前本領域亟待解決的問題之一。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，通過金屬離子選擇性的影響了二硫鍵還原和氧化，再加入金屬螯合劑和巰基反應性載荷，生成偶聯物抗體比為2的偶聯物。
2、為達此目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，所述抗體偶聯藥物的制備方法包括以下步驟：
4、(1)將含有雙特異性抗體的溶液、還原劑和金屬離子溶液混合反應；
5、(2)加入氧化劑進行氧化反應，加入淬滅劑淬滅氧化反應；
6、(3)加入金屬離子螯合劑和連接有接頭的藥物分子，反應后獲得所述偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物。
7、本專利技術通過在緩沖體系中孵育抗體、還原劑和金屬離子，金屬離子選擇性的影響了二硫鍵還原和氧化，還原劑選擇性還原抗體內的鏈間二硫鍵，再加入氧化劑對被還原的巰基進行選擇性氧化。再加入金屬螯合劑和巰基反應性載荷(如馬來酰亞胺連接藥物等)，反應生成dar值(drug-to-antibody?ratio，抗體偶聯藥物中藥物與抗體的比例)為2的偶聯物。
8、本專利技術提供了一種簡單高效，不需蛋白質工程、連接子有效載荷修飾和/或酶催化，且制備均質性得到改善的dar2的多價雙抗adc新型生物偶聯工藝，與傳統的巰基隨機偶聯過程相比，本專利技術的生物偶聯過程產生的dar2多價雙抗adc產物的均一性可以得到顯著改善，dar2的含量通常超過70wt％，最好超過80wt％，而在常規巰基隨機偶聯工藝制備的adc中，dar2的含量通常低于50wt％。
9、本專利技術工藝可用于將各種診斷、治療和標記試劑等與抗體分子偶聯，adc制備中最常見的能夠與巰基偶聯的反應基團是馬來酰亞胺。此外，還經常使用其他缺電子烯基或炔基衍生物、二硫化物的單或雙衍生物、砜、雙環丁烷衍生物、磺酰氟、五氟苯酚酯、氧化鈀加成復合物、苯碘酰、高缺電子芳烴、有機溴化物、碘化物。
10、優選地，所述還原劑包括三(2-羧乙基)磷(tcep)。
11、優選地，所述金屬離子溶液中的金屬離子包括過渡金屬離子。
12、優選地，所述過渡金屬離子包括zn2+。
13、優選地，所述含有雙特異性抗體的溶液中雙特異性抗體的濃度為0.02～0.04mm(例如可以是0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.035mm或0.04mm等)。
14、優選地，所述含有雙特異性抗體的溶液中還含有ph為6～8(例如6、6.5、7、7.5或8等)的30～50mm(例如30mm、35mm、40mm、45mm或50mm等)緩沖液。
15、優選地，所述緩沖液包括hepes、組氨酸緩沖液、pbs或mes中的任意一種或至少兩種的組合。
16、優選地，所述含有雙特異性抗體的溶液中的雙特異性抗體、還原劑和金屬離子溶液中的金屬離子摩爾比為1：(5～15)：(2～6)，優選為1：(9～11)：(3～5)。
17、上述(5～15)的具體點值可以選擇5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15等。
18、上述(2～6)的具體點值可以選擇2、3、4、5或6等。
19、上述(9～11)的具體點值可以選擇9、9.5、9.8、10、10.2、10.5或11等。
20、上述(3～5)的具體點值可以選擇3、3.5、3.8、4、4.2、4.5或5等。
21、優選地，步驟(1)中所述混合反應的條件為8～16℃(例如可以是8℃、10℃、12℃、14℃或16℃等)下靜置10～20h(例如可以是10h、12h、14h、16h、18h或20h等)。
22、優選地，所述氧化劑包括脫氫抗壞血酸(dhaa)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)中的任意一種或至少兩種的組合。
23、優選地，所述含有雙特異性抗體的溶液中的雙特異性抗體與氧化劑的摩爾比為1：(8～15)，優選為1：(9～11)。
24、上述(8～15)的具體點值可以選擇8、9、10、11、12、13、14或15等。
25、上述(9～11)的具體點值可以選擇9、9.5、9.8、10、10.2、10.5或11等。
26、優選地，步驟(2)中所述氧化反應的溫度為8～16℃(例如可以是8℃、10℃、12℃、14℃或16℃等)，時間為0.5～1.5h(例如可以是0.5h、0.7h、0.9h、1h、1.1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述抗體偶聯藥物的制備方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述還原劑包括三(2-羧乙基)磷；
3.根據權利要求1或2所述偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述氧化劑包括脫氫抗壞血酸、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的任意一種或至少兩種的組合；
4.根據權利要求1～3任一項所述偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述金屬離子螯合劑包括EDTA；
5.根據權利要求1～4任一項所述偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述雙特異性抗體含有第一Fab結構域、第二Fab結構域、第三Fab結構域和Fc結構域，所述第一Fab結構域和第二Fab結構域通過鉸鏈區與Fc結構域連接，所述第一Fab結構域和第三Fab結構域共價連接，所述第二Fab結構域和第三Fab結構域的氨基酸序列相同。<...
【技術特征摘要】
1.一種偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述抗體偶聯藥物的制備方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述還原劑包括三(2-羧乙基)磷；
3.根據權利要求1或2所述偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述氧化劑包括脫氫抗壞血酸、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸中的任意一種或至少兩種的組合；
4.根據權利要求1～3任一項所述偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述金屬離子螯合劑包括edta；
5.根據權利要求1～4任一項所述偶聯物抗體比為2的雙特異性抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述雙特異性抗體含有第一fab結構域、第二fab結構域、第三fab結構域和fc結構域，所述第一fab結構域和第二fab結構域通過鉸鏈區與fc結構域連接，所述第一fab結構域和第三f...
【專利技術屬性】
技術研發人員：魏國光，張琳，范啟睿，
申請(專利權)人：上海藥明合聯生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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