【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因編輯技術進行農作物育種，尤其涉及一種單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法及應用。
技術介紹
1、青花菜（brassica?oleracea?l.?var.?italica?plenck），又名西蘭花、綠菜花等，是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種。青花菜原產于地中海沿岸，于19世紀末傳入我國。近年來，由于其豐富的營養和特殊的保健功能受到大眾的青睞，從西餐配菜來到人民群眾的餐桌。目前青花菜育種起步晚，缺乏種質資源的積累，已經成為青花菜育種領域的關鍵核心問題（李占省,?劉玉梅,?方智遠,?等.?我國青花菜產業發展現狀、存在問題與應對策略[j].?中國蔬菜,?2019(04):?1-5.）。
2、線粒體是能量產生的場所（spinelli?j?b,?haigis?m?c.?the?multifacetedcontributions?of?mitochondria?to?cellular?metabolism[j].?nature?cell?biology,2018,?20(7):?745-754.?），線粒體基因在植物育種中具有重要作用，尤其是在細胞質雄性不育（cms）系統中，利用細胞質雄性不育系統進行雜交制種可以免除人工去雄步驟，極大地提高了制種的效率。細胞質雄性不育通常由線粒體dna（mtdna）突變引起（levings?cs,pring?dr,?1976.?restriction?endonuclease?analysis?of?mitochondrial-dna?fromnormal?and?texas
3、基因編輯技術中，crispr-cas9技術應用最為廣泛（chen?kl,?wang?yp,?zhang?r,zhang?hw,?gao?cx.?crispr/cas?genome?editing?and?precision?plant?breeding?inagriculture[j]. annual?review?of?plant?biology,?2019,?70:667-97.）。然而，crispr系統中起到識別作用的grna難以進入線粒體的雙膜系統，因此并不適用于線粒體基因組的編輯。上一代編輯工具talens僅由蛋白組成，它借助于一種由植物細菌分泌的天然蛋白tale來識別特異性dna序列，可進入線粒體。目前，線粒體的基因編輯技術均基于tale開發。東京大學農學部植物分子遺傳實驗室的arimura博士團隊首次建立基于mitotalens大片段敲除的植物線粒體基因編輯技術（kazama?t,?okuno?m,?watari?y,?yanase?s,?koizukac,?tsuruta?y,?sugaya?h,?toyoda?a,?itoh?h,?tsutsumi?n,?toriyama?k,?koizuka?n,aimura?s.?curing?cytoplasmic?male?sterility?via?talen-mediated?mitochondrialgenome?editing[j]. nature?plants,?2019,?5(7):722-730.），但該技術在敲除線粒體基因的同時會造成線粒體基因組的重組及線粒體dna大片段的缺失。目前尚無利用線粒體單堿基編輯編輯青花菜基因組的相關研究。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術針對青花菜線粒體基因組靶向編輯以及避免植物線粒體基因組重組及大片段缺失的問題。通過利用線粒體單堿基編輯技術mitotalecd對青花菜線粒體基因組進行靶向編輯。
2、本專利技術是通過以下技術方案來實現的：
3、一種單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，包括如下步驟：
4、（1）mitotalecd編輯靶位點的選擇
5、（a）利用mitotalecd技術，對細胞質雄性不育青花菜線粒體中細胞質雄性不育相關基因 orf138進行基因編輯；
6、（b）通過網站talen?targeter獲得青花菜細胞質雄性不育相關基因 orf138的左右tale識別序列的候選對，選擇針對基因 orf138構建mitotalecd載體tcd的靶位點；
7、（2）mitotalecd載體tcd的構建
8、（a）按照platinum?gate?talen?assembly?kit組裝試劑盒，使用試劑盒中的載體對tale的重復序列進行第一步的組裝，第二步使用mitotalecd的入門載體1和入門載體3，且無需使用試劑盒中的載體；
9、（b）按照lr?clonase?ii?plus的多位點gateway?lr反應，將入門載體1和入門載體3與含有talecd載體所需的啟動子、終止子、線粒體定位信號的入門載體2一起克隆到串聯表達ti質粒目的載體pk7wg2mito中；通過該反應，將進入載體1和3中的左右兩個tale、cdhalf和ugi的orf分別轉移到含有camv?35s啟動子和擬南芥atpaseδ亞基線粒體靶向信號的ti質粒中；
10、（c）通過三代測序對最終串聯表達的ti質粒進行檢查；得到構建好的mitotalecd質粒；
11、（3）利用原生質體轉化的方法評估構建好的mitotalecd質粒的有效性
12、（a）分離青花菜cms系原生質體，基于peg介導的轉化方法，將mitotalecd載體tcd轉化青花菜cms?系原生質體中，培養24?h后，提取dna；
13、（b）提取轉化mitotalecd載體tcd的原生質體dna，設計擴增靶位點的引物，進行pcr擴增，并進行sanger測序，目標堿基出現雙峰時，載體能夠使用；
14、（4）農桿菌轉化及青花菜遺傳轉化
15、（a）將構建好的mitotalecd質粒利用熱擊法轉入農桿菌gv3101中；
16、（b）將細胞質雄性不育青花菜種子消毒后播種在培養基中，以子葉為外植體進行植株再生，通過農桿菌介導的遺傳轉化，經卡那霉素抗性篩選，獲得青花菜再生苗；
17、（c）根據靶位點上下游序列，提取再生植株dna，將其作為模板進行pcr擴增，sanger測序檢測目標堿基的變化情況，tgg轉變為tag、tga或taa中的其一，則認為再生植株發生了基因編輯。
18、進一步地，所述步驟（1）中利用mitota本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，其特征在于，所述步驟（1a）中利用mitoTALECD技術，對細胞質雄性不育青花菜線粒體中細胞質雄性不育相關基因ORF138進行基因編輯，具體為：利用胞嘧啶堿基編輯器將CG堿基對轉變為TA，編輯ORF138第42個密碼子UGG對應的序列TGG，使TGG轉變為TAG、TGA或TAA，使ORF138提前終止；避免mitoTALENs技術造成的植物線粒體基因組重組及片段缺失，從而對青花菜線粒體基因進行單堿基編輯。
3.根據權利要求1所述的單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，其特征在于，所述步驟（1b）中左右TALE識別序列分別位于ORF138第42個密碼子UGG對應的序列TGG上下游，識別位點前的第一個堿基為T，長度為13-20?bp，并且兩序列之間分開12-24?bp，間隔須包含單堿基編輯的目標堿基。
4.根據權利要求1所述的單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，其特征在于，所述步驟（1b）中選擇針對基因ORF1
5.根據權利要求1所述的單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，其特征在于，所述步驟（2a）中mitoTALECD的入門載體1和入門載體3各包含一個能將胞嘧啶C轉化為尿嘧啶U的胞嘧啶脫氨酶DddA的分裂半體，即CD?half和一個抑制生成的尿嘧啶降解的尿嘧啶糖基化酶抑制劑UGI，能夠與后一步多位點Gateway?LR反應兼容。
6.根據權利要求1所述的方法在通過線粒體單堿基編輯靶向編輯青花菜線粒體基因中的應用。
7.根據權利要求6中的應用，其特征在于，編輯在青花菜細胞質中進行。
...【技術特征摘要】
1.一種單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，其特征在于，所述步驟（1a）中利用mitotalecd技術，對細胞質雄性不育青花菜線粒體中細胞質雄性不育相關基因orf138進行基因編輯，具體為：利用胞嘧啶堿基編輯器將cg堿基對轉變為ta，編輯orf138第42個密碼子ugg對應的序列tgg，使tgg轉變為tag、tga或taa，使orf138提前終止；避免mitotalens技術造成的植物線粒體基因組重組及片段缺失，從而對青花菜線粒體基因進行單堿基編輯。
3.根據權利要求1所述的單堿基靶向編輯青花菜線粒體基因的方法，其特征在于，所述步驟（1b）中左右tale識別序列分別位于orf138第42個密碼子ugg對應的序列tgg上下游，識別位點前的第一個堿基為t，長度為...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊景華，許鳳媛，范福艷，張明方，胡仲遠，
申請(專利權)人：浙江大學海南研究院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。