【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及免疫治療領域，具體地，涉及一種包含編碼特異性結合腫瘤相關抗原的合成型t細胞抗原受體(star)的核苷酸序列的核酸構建體，以及由所述核酸構建體制備的工程t細胞。本申請還涉及所述核酸構建體和所述工程t細胞在藥物開發，腫瘤和自身免疫性疾病等治療中的用途。
技術介紹
1、細胞免疫治療，如嵌合抗原受體t細胞(chimeric?antigen?receptor?t-cell,car-t)免疫療法在近十年間徹底改變了癌癥的治療格局，許多已無藥可治的血液瘤患者在接受了car-t細胞療法后，腫瘤受到了顯著的控制，部分患者甚至完全康復，在多種癌癥的治療中表現出巨大的應用前景。
2、細胞免疫治療中，如car-t細胞的成功制備是免疫治療應用最關鍵的一步，目前自體或異體car-t細胞的臨床前和臨床制備在很大程度上依賴于使用病毒載體(如逆轉錄病毒、慢病毒)將識別腫瘤特異性抗原的car轉基因轉導進t細胞。然而，通過病毒轉導遞送到t細胞的car轉基因會隨機整合到宿主dna中，可能會引起t細胞的快速增殖或者轉錄沉默等現象，帶來難以預見的風險和可變的轉基因表達。此外，如果car整合到致癌位點，則該隨機整合可能導致t細胞致癌性轉化，并且病毒載體制備耗時、昂貴，并面臨生物安全挑戰。克服病毒轉導隨機整合的一種方法是位點特異性基因定點整合，該方法是利用crispr/cas9基因編輯結合aav載體遞送系統，將識別腫瘤特異性抗原的car轉基因定點插入整合到t細胞某一特異基因位點。如目前應用最為廣泛的是在t細胞trac(t-cell?receptor?
3、因此，需要提供一種核酸構建體和方法以解決在car?t細胞安全性、高效性、快速和經濟廉價制備的問題。
技術實現思路
1、本申請的專利技術人經過大量實驗和反復摸索，本專利技術對非病毒雙鏈dna作為hdr模板進行了結構優化設計，聯合crispr/cas12a?ultra基因編輯系統在人類t細胞實現了多種不同目的基因高效定點編輯，可實現大片段目的基因的定點插入整合，并可應用于多種不同類型的人和小鼠細胞，實現人和小鼠細胞的定點基因編輯。本專利技術提供了一種基于結構優化雙鏈dna和crispr/cas12a?ultra系統高效定點編輯人細胞的方法和應用，可高效、低廉、快速制備安全性更高的star-t細胞以及定點編輯細胞，在人細胞多個基因特異位點實現高效的定點插入整合，可實現7kb以上基因的定點編輯。
2、核酸構建體
3、因此，在第一方面，本申請提供了一種核酸構建體，其包含編碼特異性結合腫瘤相關抗原的合成型t細胞抗原受體(star)的核苷酸序列，以及在所述star的核苷酸序列兩側的第一引導序列和第二引導序列；其中，所述第一引導序列和第二引導序列包含能夠被cas12a蛋白識別的pam序列和能夠與所述cas12a蛋白結合的crrna序列。
4、在某些實施方案中，所述第一引導序列和第二引導序列中的pam序列位于靠近所述star的一端。
5、在某些實施方案中，所述第一引導序列位于所述star的3’端，且第一引導序列從5’端到3’端依次包含所述pam序列和所述crrna序列。
6、在某些實施方案中，所述第二引導序列位于所述star的5’端，且第二引導序列從5’端到3’端依次包含所述crrna序列和所述pam序列。
7、在某些實施方案中，所述核酸構建體在star和第一引導序列之間還包含第一同源臂序列，并且所述核酸構建體在star和第二引導序列之間還包含第二同源臂序列。
8、在某些實施方案中，所述第一同源臂序列和第二同源臂序列與靶序列兩側的序列相同。
9、在某些實施方案中，所述第一同源臂序列與靶序列下游的序列相同，且所述第二同源臂序列與靶序列上游的序列相同。
10、在某些實施方案中，所述靶序列包含與所述crrna序列互補的序列。
11、在某些實施方案中，所述靶序列臨近所述cas12a蛋白所識別的pam序列。
12、在某些實施方案中，所述靶序列位于所述pam序列的3’端。
13、在某些實施方案中，所述靶序列位于免疫細胞的基因組中。
14、在某些實施方案中，所述靶序列位于t細胞的內源基因的序列中。
15、在某些實施方案中，所述內源基因選自b2m，tet2，pd1，bcor，regnase，roquin-1或trac。
16、在某些實施方案中，所使用的靶向t細胞內源b2m基因的crrna具有如seq?id?no:2所示的序列。
17、在某些實施方案中，所使用的靶向t細胞內源tet2基因的crrna具有如seq?id?no:3所示的序列。
18、在某些實施方案中，所使用的靶向t細胞內源pd1基因的crrna具有如seq?id?no:4所示的序列。
19、在某些實施方案中，所使用的靶向t細胞內源regnase基因的crrna具有如seq?idno:5所示的序列。
20、在某些實施方案中，所使用的靶向t細胞內源roquin-1基因的crrna具有如seq?idno:6所示的序列。
21、在某些實施方案中，所使用的靶向t細胞內源trac基因的crrna具有如seq?id?no:7所示的序列。
22、在某些實施方案中，所述核酸構建體還包含本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種核酸構建體，其包含編碼特異性結合腫瘤相關抗原的合成型T細胞抗原受體(STAR)的核苷酸序列，以及在所述STAR的核苷酸序列兩側的第一引導序列和第二引導序列；其中，所述第一引導序列和第二引導序列包含能夠被Cas12a蛋白識別的PAM序列和能夠與所述Cas12a蛋白結合的crRNA序列。
2.權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述第一引導序列和第二引導序列中的PAM序列位于靠近所述STAR的一端；
3.權利要求1或2所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體在STAR和第一引導序列之間還包含第一同源臂序列，并且所述核酸構建體在STAR和第二引導序列之間還包含第二同源臂序列；
4.權利要求3所述的核酸構建體，其中，所述靶序列包含與所述crRNA序列互補的序列；
5.權利要求1-4任一項所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體還包含編碼調節元件的核苷酸序列；
6.權利要求1-5任一項所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體包含：第二引導序列，第二同源臂，STAR，第一同源臂，第一引導序列；
7.權利要求1-6任一項所
8.權利要求1-7任一項所述的核酸構建體，其中，所述Cas12a蛋白選自天然的Cas12a蛋白，Cas12a蛋白的突變體，Cas12a蛋白的同源物，或其任意組合。
9.權利要求1-8任一項所述的核酸構建體，其中，所述腫瘤相關抗原選自：CD19、EGFR、CD20、CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮細胞粘附分子(EpCAM)、間皮素MSLN、表皮生長因子受體(EGFR)、EGFR變體III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、雙唾液酸神經節苷脂GD2、導管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神經膠質瘤相關的抗原、β-人絨毛膜促性腺激素、α胎兒球蛋白(AFP)、外源凝集素反應性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA?IX、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut?hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰島素生長因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受體、呈遞腫瘤特異性肽表位的主要組織相容性復合體(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、腫瘤基質抗原、纖維連接蛋白的額外結構域A(EDA)和額外結構域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1結構域(TnC?A1)、成纖維細胞相關蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、細胞因子受體、內皮因子、主要組織相容性復合體(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROTQ02223)、SLAMF7(UNIPROT?Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT?Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT?Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT?P53708)、FCRL5(UNIPROT?Q68SN8)，或其任意組合。
10.權利要求1-9任一項所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體具有選自下列的一項或多項特征：
11.權利要求1-10任一項所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體具有選自下列的一項或多項特征：
12.權利要求1-11任一項所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體具有選自下列的一項或多項特征：
13.一種載體，其包含權利要求1-12任一項所述的核酸構建體；優選地，所述載體為克隆載體或表達載體。
14.一種宿主細胞，其包含權利要求1-12任一項所述的核酸構建體或權利要求13所述的載體；
15.一種試劑盒，其包含下列(1)至(3)中的至少1項(例如，1項，2項，3項)：
16.權利要求15所述的試劑盒，其還包含下列(4)至(8)中的任意一項或多項(例如，1項，2項，3項，4項，5項)：
17.一種制備工程T細胞的方法，...
【技術特征摘要】
1.一種核酸構建體，其包含編碼特異性結合腫瘤相關抗原的合成型t細胞抗原受體(star)的核苷酸序列，以及在所述star的核苷酸序列兩側的第一引導序列和第二引導序列；其中，所述第一引導序列和第二引導序列包含能夠被cas12a蛋白識別的pam序列和能夠與所述cas12a蛋白結合的crrna序列。
2.權利要求1所述的核酸構建體，其中，所述第一引導序列和第二引導序列中的pam序列位于靠近所述star的一端；
3.權利要求1或2所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體在star和第一引導序列之間還包含第一同源臂序列，并且所述核酸構建體在star和第二引導序列之間還包含第二同源臂序列；
4.權利要求3所述的核酸構建體，其中，所述靶序列包含與所述crrna序列互補的序列；
5.權利要求1-4任一項所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體還包含編碼調節元件的核苷酸序列；
6.權利要求1-5任一項所述的核酸構建體，其中，所述核酸構建體包含：第二引導序列，第二同源臂，star，第一同源臂，第一引導序列；
7.權利要求1-6任一項所述核酸構建體，其中，所述核酸構建體包含：第二引導序列，第二同源臂，啟動子，star，自剪切多肽，第一同源臂，第一引導序列；
8.權利要求1-7任一項所述的核酸構建體，其中，所述cas12a蛋白選自天然的cas12a蛋白，cas12a蛋白的突變體，cas12a蛋白的同源物，或其任意組合。
9.權利要求1-8任一項所述的核酸構建體，其中，所述腫瘤相關抗原選自：cd19、egfr、cd20、cd16、cd64、cd78、cd96、cll1、cd116、cd117、cd71、cd45、cd71、cd123、cd138、erbb2(her2/neu)、癌胚抗原(cea)、上皮細胞粘附分子(epcam)、間皮素msln、表皮生長因子受體(egfr)、egfr變體iii(egfrviii)、cd19、cd20、cd30、cd40、雙唾液酸神經節苷脂gd2、導管上皮粘蛋白、gp36、tag-72、鞘糖脂、神經膠質瘤相關的抗原、β-人絨毛膜促性腺激素、α胎兒球蛋白(afp)、外源凝集素反應性afp、甲狀腺球蛋白、rage-1、mn-ca?ix、人端粒酶逆轉錄酶、ru1、ru2(as)、腸羧基酯酶、mut?hsp70-2、m-csf、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特異性抗原(psa)、pap、ny-eso-1、laga-1a、p53、prostein、psma、存活和端粒酶、前列腺癌腫瘤抗原-1(pcta-1)、mage、elf2m、嗜中性粒細胞彈性蛋白酶、肝配蛋白b2、cd22、胰島素生長因子(igf1)-i、igf-ii、igfi受體、呈遞腫瘤特異性肽表位的主要組織相容性復合體(mhc)分子、5t4、ror1、nkp30、nkg2d、腫瘤基質抗原、纖維連接蛋白的額外結構域a(eda)和額外結構域b(edb)、腱生蛋白-c的a1結構域(tnc?a1)、成纖維細胞相關蛋白(fap)...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉宏濤，王惠敏，王嘉盛，林欣，
申請(專利權)人：北京昌平實驗室，
類型：發明
國別省市：
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