【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于疫苗株，具體涉及一種高增殖能力pcv2株及構建方法和應用。
技術介紹
1、豬圓環病毒病(porcine?circovirus?disease,pcvd)是由豬圓環病毒2型(porcine?circovirus?type?2,pcv2)引起的一種傳染病，對全球養豬業構成了巨大威脅。該病毒主要侵害豬的免疫系統，導致免疫抑制，從而使得豬只對其他病原體更加易感，并可能出現多種臨床癥狀，如斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaning?multisystemicwasting?syndrome,pmws)、豬皮炎腎炎綜合征(pdns)和豬呼吸道疾病綜合征(prdc)等。
2、pcv2疫苗的免疫能夠提供很好的保護，而且效果明顯，得到普遍認可，如明顯降低死亡率、減少死淘率、提高生產成績以及降低藥物治療費用等。然而，在pcv2疫苗的研制過程中，由于pcv2極小的基因組限制了其編碼能力，導致其體外增殖能力差，培養物病毒含量低，病毒接種細胞不產生病變，病毒含量不易測定，病毒感染動物臨床反應不一，免疫力評價困難。其中提高疫苗的抗原量是pcv2疫苗生產和應用的瓶頸，因此進行pcv2疫苗的生產時，常從臨床分離毒株中篩選高繁殖能力毒株，再經過在傳代細胞系上連續傳代的方法獲得疫苗株，但該方法研發周期長，且存在繁殖能力提升有限的問題。
3、豬圓環病毒病(porcine?circovirus?disease,pcvd)是由豬圓環病毒2型(porcine?circovirus?type?2,pcv2)引起的一種傳染病，對全球
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種高增殖能力pcv2株及構建方法和應用，無需分離菌株即可得到高增殖能力pcv2株，可作為pcv2疫苗生產的抗原材料。
2、本專利技術一個優選方式中，包括將豬圓環病毒的cap段第492bp的a點突變為g。
3、本專利技術還提供了一種引發豬圓環病毒cap段第492bp的a點突變為g的引物對，包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的capa492g-f和seq?id?no.2所示的capa492g-r。
4、本專利技術還提供了一種引發豬圓環病毒cap段第492bp的a點突變為g的方法，包括以下步驟：以豬圓環病毒基因組為模板，利用上述引物對進行擴增，基于dpn?i酶將擴增產物轉化入大腸桿菌中，挑選陽性菌株提取得pcv2-capa492g質粒；
5、將pcv2-capa492g質粒單酶切后，將酶切的線性化片段連接得環化質粒；
6、利用所述環化質粒轉染宿主細胞，得cap段第492bp的a點突變為g的突變株。
7、本專利技術一個優選方式中，所述豬圓環病毒基因組的來源包括豬圓環病毒2型毒株。
8、本專利技術一個優選方式中，所述擴增的程序，包括：98℃預變性30s；98℃變性15s，60℃退火5s，72℃延伸10s，30個循環；72℃終延伸1min。
9、本專利技術一個優選方式中，所述宿主細胞包括pk15細胞。
10、本專利技術還提供了利用上述方法構建得到的cap段第492bp的a點突變為g的突變株。
11、本專利技術還提供了上述突變株在制備抗豬圓環病毒疫苗中的應用。
12、本專利技術還提供了一種抗豬圓環病毒疫苗，活性成分包括上述突變株的滅活株。
13、有益效果：本專利技術提供了一種提高豬圓環病毒增殖能力的方法，通過將豬圓環病毒毒株的cap段的492bp位點的a進行點突變，經所述點突變后，即可顯著增強毒株的增殖能力。本專利技術實施例中，通過對豬圓環病毒2型毒株進行cap段的492bp位點的突變，從而得到pcv2-capa492g突變毒株，與pcv2野生型毒株相比，突變毒株的病毒滴度顯著上調；且相比于pcv2野生型毒株相比，cap蛋白表達水平顯著提高；使用sybr?green法進行絕對定量檢測，發現突變毒株核酸絕對定量顯著提高，證實經本專利技術所述a492g點突變后，可顯著提高豬圓環病毒的增殖能力。
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1.一種提高豬圓環病毒增殖能力的方法，其特征在于，包括將豬圓環病毒的Cap段第492bp的A點突變為其他堿基類型。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，包括將豬圓環病毒的Cap段第492bp的A點突變為G。
3.一種引發豬圓環病毒Cap段第492bp的A點突變為G的引物對，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示的CapA492G-F和SEQ?ID?No.2所示的CapA492G-R。
4.一種引發豬圓環病毒Cap段第492bp的A點突變為G的方法，其特征在于，包括以下步驟：以豬圓環病毒基因組為模板，利用權利要求3所述引物對進行擴增，基于Dpn?I酶將擴增產物轉化入大腸桿菌中，挑選陽性菌株提取得PCV2-capA492G質粒；
5.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述豬圓環病毒基因組的來源包括豬圓環病毒2型毒株。
6.根據權利要求4所述方法，其特征在于，所述擴增的程序，包括：98℃預變性30s；98℃變性15s，60℃退火5s，72℃延伸10s，30個循環；72℃終延伸1min。
7.根
8.利用權利要求4～7任一項所述方法構建得到的Cap段第492bp的A點突變為G的突變株。
9.權利要求8所述突變株在制備抗豬圓環病毒疫苗中的應用。
10.一種抗豬圓環病毒疫苗，其特征在于，活性成分包括權利要求8所述突變株的滅活株。
...【技術特征摘要】
1.一種提高豬圓環病毒增殖能力的方法，其特征在于，包括將豬圓環病毒的cap段第492bp的a點突變為其他堿基類型。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，包括將豬圓環病毒的cap段第492bp的a點突變為g。
3.一種引發豬圓環病毒cap段第492bp的a點突變為g的引物對，其特征在于，包括核苷酸序列如seq?id?no.1所示的capa492g-f和seq?id?no.2所示的capa492g-r。
4.一種引發豬圓環病毒cap段第492bp的a點突變為g的方法，其特征在于，包括以下步驟：以豬圓環病毒基因組為模板，利用權利要求3所述引物對進行擴增，基于dpn?i酶將擴增產物轉化入大腸桿菌中，挑選陽性菌株提取得pcv2...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周繼勇，胡婧宇，顧金燕，徐珂莎，王文婧，顏焰，金玉蘭，董偉仁，陳文鏡，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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