【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，具體涉及一種基因修飾增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌功能的方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical?cord?mesenchymal?stem?cells,uc-mscs)是從新生兒臍帶華通氏膠中分離出來(lái)的一類多能干細(xì)胞。uc-mscs因其易于獲取、低免疫原性、高增殖能力和多向分化潛能，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。它們已被用于治療多種疾病，包括但不限于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦卒中、帕金森病、脊髓損傷等；心血管疾病，如心肌梗死、缺血性心臟病等；自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等；肝臟疾病，如肝硬化、急性肝衰竭等；骨科疾病，如骨關(guān)節(jié)炎、骨折愈合等。uc-mscs的治療效果主要?dú)w因于其強(qiáng)大的旁分泌功能，能夠分泌多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和外泌體，這些因子可以促進(jìn)血管新生、抑制炎癥反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡并促進(jìn)受損組織的修復(fù)。例如，在腦卒中的治療中，uc-mscs可以通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)等因子促進(jìn)神經(jīng)元的存活和血管生成，從而改善患者的神經(jīng)功能。
2、盡管uc-mscs在臨床應(yīng)用中顯示出良好的前景，但仍存在一些不足之處，如旁分泌功能有限。在某些情況下，uc-mscs的旁分泌功能不足以達(dá)到理想的治療效果。特別是在需要高水平細(xì)胞因子支持的情況下，如嚴(yán)重的組織損傷或慢性疾病。再如，移植后的存活率和功能維持，uc-mscs在移植后可能會(huì)受到宿主微環(huán)境的影響，導(dǎo)致存活率下降或功能減弱。
3、目前的為了克服原代msc的不足，研究人員采取了多種策
4、因此，提供一種安全性高、能夠明顯增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌功能的方法是目前亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是提供一種基因修飾增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌功能的方法及其應(yīng)用。
2、為實(shí)現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：
3、一方面，本專利技術(shù)提供了一種基因修飾增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌功能的方法，包括將目標(biāo)基因與氧敏感序列連接后通過(guò)載體導(dǎo)入到間充質(zhì)干細(xì)胞中；
4、所述的氧敏感序列包括缺氧反應(yīng)元件hre和缺氧誘導(dǎo)因子hif-1α增強(qiáng)子序列，hre序列為tcacgtg，hif-1α增強(qiáng)子序列如seq?id?no:1所示。
5、具體地，所述的目標(biāo)基因包括但不限于vegf、hgf。
6、進(jìn)一步地，所述的目標(biāo)基因?yàn)関egf。
7、具體地，所述的hre序列和hif-1α增強(qiáng)子序列兩端包含ecori和bamhi限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。
8、具體地，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。
9、進(jìn)一步地，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
10、具體地，所述的方法包括以下步驟：
11、(1)擴(kuò)增hre序列和hif-1α增強(qiáng)子序列；
12、(2)將擴(kuò)增得到的hre序列和hif-1α增強(qiáng)子序列進(jìn)行酶切，同時(shí)對(duì)載體進(jìn)行酶切；
13、(3)將酶切后的序列通過(guò)連接酶插入到載體中，轉(zhuǎn)染到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝，得到慢病毒顆粒；
14、(4)將間充質(zhì)干細(xì)胞在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70-80％融合時(shí)，加入包含慢病毒顆粒的轉(zhuǎn)染混合物進(jìn)行培養(yǎng)。
15、進(jìn)一步地，步驟(1)為使用pcr擴(kuò)增hre序列和hif-1α增強(qiáng)子序列；
16、再進(jìn)一步地，hre正向引物如seq?id?no:2所示，hre反向引物如seq?id?no:3所示。
17、再進(jìn)一步地，hif-1α增強(qiáng)子正向引物如seq?id?no:4所示，hif-1α增強(qiáng)子反向引物如seq?id?no:5所示。
18、具體地，所述的hre正向引物中包含ecori位點(diǎn)，hre反向引物中包含bamhi位點(diǎn)。
19、具體地，所述的hif-1α增強(qiáng)子正向引物中包含ecori位點(diǎn)，hif-1α增強(qiáng)子反向引物中包含bamhi位點(diǎn)。
20、具體地，步驟(2)中為使用ecori酶和bamhi酶對(duì)hre序列和hif-1α增強(qiáng)子序列進(jìn)行雙酶切。
21、具體地，步驟(2)中所述的載體包括但不限于慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。
22、進(jìn)一步地，所述的載體為慢病毒載體。
23、具體地，步驟(2)中為使用使用ecori酶和bamhi酶對(duì)載體進(jìn)行雙酶切。
24、根據(jù)本專利技術(shù)的一些實(shí)施方式，所述的載體為plenti-cmv-vegf-ires-gfp質(zhì)粒。
25、具體地，步驟(3)中所述的連接酶包括但不限于t4?dna連接酶、t7?dna連接酶。
26、進(jìn)一步地，所述的連接酶為t4?dna連接酶。
27、具體地，步驟(3)中所述的感受態(tài)細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌、酵母菌或枯草芽孢桿菌。
28、進(jìn)一步地，所述的感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌。
29、具體地，步驟(3)中慢病毒包裝為將構(gòu)建好的載體、包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。
30、進(jìn)一步地，所述的包裝質(zhì)粒包括pspax2質(zhì)粒和pmd2.g質(zhì)粒。
31、進(jìn)一步地，所述的細(xì)胞為hek293t細(xì)胞。
32、具體地，步驟(4)中所述的低氧條件中包含1-3％o2；進(jìn)一步地，所述的低氧條件中包含3％o2。
33、具體地，步驟(4)中間充質(zhì)干細(xì)胞的含量為5×105個(gè)細(xì)胞/孔。
34、具體地，步驟(4)中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基包括但不限于dmem/f12培養(yǎng)基、mrs培養(yǎng)基、m17培養(yǎng)基、pda培養(yǎng)基、lb培養(yǎng)基、tb培養(yǎng)基、sob培養(yǎng)基、mem培養(yǎng)基、rpmi1640培養(yǎng)基。
35、進(jìn)一步地，步驟(4)中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基(含10％fbs)。
36、根據(jù)本專利技術(shù)的一些實(shí)施方式，所述的培養(yǎng)基中可包含特定生長(zhǎng)因子，所述的生長(zhǎng)因子包括但不限于胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(igf-1)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)等。
37、具體地，步驟(4)中所述的轉(zhuǎn)染混合物包括培養(yǎng)基和慢病毒顆粒；進(jìn)一步地，所述的培養(yǎng)基為dmem/f12培養(yǎng)基，慢病毒顆粒的moi為10。
38、具體地，步驟(4)中加入轉(zhuǎn)染混合物后培養(yǎng)的時(shí)間為48-72h；進(jìn)一步地，加入轉(zhuǎn)染混合物后培養(yǎng)的時(shí)間為72h。
39、又一方面，本專利技術(shù)提供了上述的方法制備得到的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。
40、具體地，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。
41、進(jìn)一步地，所述的間本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基因修飾增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌功能的方法，其特征在于，包括將目標(biāo)基因與氧敏感序列連接后通過(guò)載體導(dǎo)入到間充質(zhì)干細(xì)胞中；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標(biāo)基因?yàn)閂EGF。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)為使用PCR擴(kuò)增HRE序列和HIF-1α增強(qiáng)子序列；HRE正向引物如SEQ?ID?NO:2所示，HRE反向引物如SEQ?ID?NO:3所示；HIF-1α增強(qiáng)子正向引物如SEQ?ID?NO:4所示，HIF-1α增強(qiáng)子反向引物如SEQ?ID?NO:5所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的載體包括慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體。
8.根據(jù)權(quán)利
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的低氧條件中包含1-3％O2。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的低氧條件中包含3％O2。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(4)中加入轉(zhuǎn)染混合物后培養(yǎng)的時(shí)間為48-72h。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法制備得到的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療缺血性心腦血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
14.一種藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物中包括權(quán)利要求12所述的基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基因修飾增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌功能的方法，其特征在于，包括將目標(biāo)基因與氧敏感序列連接后通過(guò)載體導(dǎo)入到間充質(zhì)干細(xì)胞中；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目標(biāo)基因?yàn)関egf。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)為使用pcr擴(kuò)增hre序列和hif-1α增強(qiáng)子序列；hre正向引物如seq?id?no:2所示，hre反向引物如seq?id?no:3所示；hif-1α增強(qiáng)子正向引物如seq?id?no:4所示，hif-1α增強(qiáng)子反向引物如s...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂秋軍，吳清法，葛津宏，吳純陽(yáng)，羅衛(wèi)兵，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京再生世紀(jì)生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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