【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種高均一性的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、抗體藥物偶聯(lián)物是指治療藥物與靶標(biāo)特異性抗體連接，將藥物導(dǎo)向靶標(biāo)并釋放產(chǎn)生治療效果的一組治療藥物。其中抗體-寡核苷酸偶聯(lián)藥物(aoc)作為新型合成生物偶聯(lián)物在生物分析和靶向基因治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，開(kāi)發(fā)新的aoc作為治療藥物具有重要意義。然而，傳統(tǒng)的偶聯(lián)過(guò)程會(huì)隨機(jī)將藥物部分偶聯(lián)在抗體的不同位點(diǎn)，從而導(dǎo)致偶聯(lián)產(chǎn)品的異質(zhì)性。根據(jù)反應(yīng)條件，異質(zhì)性的偶聯(lián)物通常含有0至約8個(gè)或更多連接藥物部分的抗體分布。這種混合物中的每種結(jié)合產(chǎn)物可能具有不同的藥代動(dòng)力學(xué)、分布、毒性和有效性特征。
2、同質(zhì)寡核苷酸抗體偶聯(lián)物在診斷，免疫檢測(cè)，定量和成像應(yīng)用中提供了更準(zhǔn)確的結(jié)果。同質(zhì)性改善的抗體藥物偶聯(lián)物在治療中獲益，例如更高的治療指數(shù)、改善療效和降低藥物毒性。因此，工藝簡(jiǎn)單，成本可控的制備高均一性aocs的新工藝是非常必要和需要長(zhǎng)期追求的。
3、目前，全球范圍內(nèi)還沒(méi)有獲批上市的aoc產(chǎn)品，但至少有20余家公司擁有超過(guò)30個(gè)臨床前管線。avidity?biosciences作為aoc藥物研發(fā)領(lǐng)域先驅(qū)，其aoc?1001是第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的aoc，以sirna有效載荷靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體i(tffi)，用于治療i型肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良。在目前aoc藥物的研發(fā)中，其偶聯(lián)技術(shù)主要分為隨機(jī)偶聯(lián)和定點(diǎn)偶聯(lián)。隨機(jī)偶聯(lián)又細(xì)分為半胱氨酸和賴氨酸偶聯(lián)，此種方法容易產(chǎn)生異質(zhì)性的aoc；定點(diǎn)偶聯(lián)主要涉及工程化抗體改造，如在抗體中加入非天然氨基酸，改變抗
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種高均一性的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法及其應(yīng)用。本專利技術(shù)提供了一種簡(jiǎn)單高效，不需蛋白質(zhì)工程、連接子有效載荷修飾和/或酶催化，制備均一性得到改善的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物(aoc)的新型生物偶聯(lián)工藝。與傳統(tǒng)的涉及雙巰基反應(yīng)的偶聯(lián)過(guò)程相比，本專利技術(shù)的生物偶聯(lián)過(guò)程產(chǎn)生的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物(aoc)產(chǎn)物的均一性可以得到顯著改善。具體而言，采用本專利技術(shù)工藝制備的aoc中，d1的含量通常超過(guò)60wt％，最好超過(guò)75wt％，而采用常規(guī)雙巰基偶聯(lián)工藝制備的adc中，d1的含量通常低于50wt％。
2、為達(dá)到此專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供一種高均一性的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，所述方法包括：
4、(s1)在緩沖液體系中將還原劑和過(guò)渡金屬離子與待偶聯(lián)的抗體孵育，選擇性還原抗體內(nèi)的鏈間二硫鍵；
5、(s2)加入氧化劑對(duì)還原的巰基進(jìn)行選擇性氧化；氧化反應(yīng)后采用dippbs淬滅氧化；
6、(s3)加入金屬螯合劑和巰基反應(yīng)性載荷，偶聯(lián)反應(yīng)生成dar值為1的抗體連接子偶聯(lián)物；
7、(s4)抗體連接子偶聯(lián)物與含有疊氮基團(tuán)的寡核苷酸通過(guò)加成反應(yīng)生成dar值為1的寡核苷酸抗體偶聯(lián)物。
8、本專利技術(shù)的生物偶聯(lián)工藝，用于制備均一性更好的dar1(寡核苷酸抗體比為1)。在制備工藝中通過(guò)控制二硫鍵還原和巰基氧化，無(wú)需蛋白質(zhì)工程、酶催化或有效載荷修飾，使得巰基選擇性地和待反應(yīng)連接子偶聯(lián)，將一分子的連接子偶聯(lián)到抗體的一對(duì)打開(kāi)的二硫鍵上，再將寡核苷酸偶聯(lián)到抗體連接子上。該工藝可生產(chǎn)均一性提高的dar1?aoc，且具有操作簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)該方法，可以將大多數(shù)天然人igg1抗體與各種連接子(有雙巰基反應(yīng)性)偶聯(lián)到dar1adc中，再將寡核苷酸和抗體連接子偶聯(lián)，形成dar1的aoc。
9、本專利技術(shù)中，巰基反應(yīng)性載荷上含有與抗體偶聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)，還含有與目標(biāo)負(fù)載連接的反應(yīng)基團(tuán)。
10、本專利技術(shù)中，所述目標(biāo)負(fù)載例如是核酸藥物反義核酸、磷酸二酰胺嗎啉代寡聚物、小干擾rna、微小rna、核酸適配體或cpg寡脫氧核苷酸等。所述目標(biāo)負(fù)載上含有與巰基反應(yīng)性載荷連接的反應(yīng)基團(tuán)。
11、本專利技術(shù)將基于抗體鏈間半胱氨酸偶聯(lián)的寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的平均dar值拓展到1，獲得均一性良好的產(chǎn)品。進(jìn)一步滿足目前偶聯(lián)領(lǐng)域?qū)慌悸?lián)物抗體比為1的aoc的需求，適用性廣，應(yīng)用潛力大。
12、優(yōu)選地，(s1)中，所述緩沖液體系選自：hepes緩沖液、組氨酸緩沖液、pbs緩沖液或mes緩沖液中任意一種。
13、優(yōu)選地，(s1)中，所述還原劑選自：三(2-羧乙基)膦(tcep)、thpp(三(3-羥丙基)膦)、二ppb(2-二苯基膦酰苯磺酸)、dtt(二硫蘇糖醇)、dpaa(2-(二苯基膦)乙酸)、dte(二硫赤蘚糖醇)、β-巰基乙醇、lialh4、na2s2o3、kbh4或肼中任意一種或至少兩種的組合；優(yōu)選為三(2-羧乙基)膦(tcep)、thpp(三(3-羥丙基)膦)、二ppb(2-二苯基膦酰苯磺酸)或dpaa(2-(二苯基膦)乙酸)。
14、優(yōu)選地，(s1)中，所述過(guò)渡金屬離子為zn2+。
15、在本專利技術(shù)中，過(guò)渡金屬離子選擇性的影響了二硫鍵還原和氧化，加入有效量的金屬螯合劑(如edta)和過(guò)量的可與雙巰基反應(yīng)的連接子(如雙馬來(lái)酰亞胺連接藥物等)后，得到高均質(zhì)的dar1的抗體連接子偶聯(lián)物，再將其與過(guò)量的寡核苷酸偶聯(lián)，得到高均質(zhì)的dar1aoc的產(chǎn)品。
16、優(yōu)選地，(s1)中，所述抗體選自：trastuzumab、cetuximab或rituximab中任意一種。
17、優(yōu)選地，(s1)中，所述孵育的體系中過(guò)渡金屬離子與抗體的摩爾比為(0.5-50):1，例如可以是0.5:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1等；優(yōu)選為(1-16):1，例如可以是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1或16:1等；進(jìn)一步優(yōu)選為(2-8):1。
18、優(yōu)選地，(s1)中，所述孵育的體系中還原劑與抗體的摩爾比為(1-20):1，例如可以是1:1、5:1、10:1、15:1或20:1等；優(yōu)選為(2-16):1，例如可以是2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1或16:1等；進(jìn)一步優(yōu)選為(3-8):1。
19、本專利技術(shù)中，還原劑過(guò)渡金屬離子的用量相比抗體更為過(guò)量。
20、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以相對(duì)于抗體4倍的摩爾比加入過(guò)渡金屬離子，即，過(guò)渡金屬離子/抗體的摩爾比為4。
21、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以相對(duì)于抗體8倍的摩爾比加入還原劑，即，還原劑/抗體的摩爾比為8。
22、優(yōu)選地，(s1)中，所述孵育的條件為：在0-37℃靜置0.5-72h本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(S1)中，所述緩沖液體系選自：Hepes緩沖液、組氨酸緩沖液、PBS緩沖液或MES緩沖液中任意一種；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(S1)中，所述孵育體系中過(guò)渡金屬離子與抗體的摩爾比為(0.5-50):1，優(yōu)選為(1-16):1，進(jìn)一步優(yōu)選為(2-8):1；
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(S2)中，所述氧化劑選自：過(guò)氧化氫、硝酸鹽化合物、氯化鉀、過(guò)氧化二硫酸、過(guò)氧單硫酸、NaClO、重鉻酸鈉、高錳酸鹽化合物、高硼酸鈉、氧化亞氮、鉍酸鈉、硫酸鈰、脫氫抗壞血酸、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或2-氨基苯基二硫化物中任意一種或至少兩種的組合；
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的高均一性的DA
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(S3)中，所述金屬螯合劑與抗體的摩爾比為(2-40):1，優(yōu)選為(30-40):1；
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(S3)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)還包括純化的步驟；
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(S4)中，所述寡核苷酸選自小干擾核糖核酸和/或反義寡核苷酸；
9.一種DAR1抗體核酸偶聯(lián)物，其特征在于，所述抗體核酸偶聯(lián)物由權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法制備得到。
10.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的高均一性的DAR1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法在制備AOC藥物中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種高均一性的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高均一性的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(s1)中，所述緩沖液體系選自：hepes緩沖液、組氨酸緩沖液、pbs緩沖液或mes緩沖液中任意一種；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的高均一性的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(s1)中，所述孵育體系中過(guò)渡金屬離子與抗體的摩爾比為(0.5-50):1，優(yōu)選為(1-16):1，進(jìn)一步優(yōu)選為(2-8):1；
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的高均一性的dar1寡核苷酸抗體偶聯(lián)物的制備方法，其特征在于，(s2)中，所述氧化劑選自：過(guò)氧化氫、硝酸鹽化合物、氯化鉀、過(guò)氧化二硫酸、過(guò)氧單硫酸、naclo、重鉻酸鈉、高錳酸鹽化合物、高硼酸鈉、氧化亞氮、鉍酸鈉、硫酸鈰、脫氫抗壞血酸、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或2-氨基苯基二硫化物中任意一種或至少兩種的組合；
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：范啟睿，王佳，張琳，王澤坤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海藥明合聯(lián)生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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