【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及抗體，尤其涉及一種用于雙特異抗體偶聯藥物的制備方法。
技術介紹
1、抗體是一種具有多種功能的免疫球蛋白，但是天然的單抗只有一個抗原結合片段(antigen-binding?fragment，fab)，即只有單一的抗原結合表位，限制了其在疾病治療中發揮的作用。雙特異性抗體(bispecific?antibody，bsab，簡稱雙抗)是指能同時特異性結合兩個抗原或抗原表位的人工抗體。它能同時靶向細胞表面不同的抗原或表位，增強其與腫瘤細胞的特異性結合并直接殺傷腫瘤細胞，相較單抗的組合療法，也可以有效降低治療成本。
2、抗體偶聯藥物(antibody-drug?conjugates,adc)通過抗體-抗原相互作用將細胞毒性藥物導向抗原表達細胞或其他靶細胞，因此與單獨使用抗體或小分子藥物相比，adc兼具了小分子與抗體藥物的雙重優勢。目前已經有10款雙抗adc進入了臨床階段，其中大部分雙抗adc均采用引入工程反應性半胱氨酸殘基或利用鏈間二硫鍵進行隨機偶聯的方式實現小分子藥物在雙抗上的位點特異性偶聯。工程反應性半胱氨酸殘基技術的缺陷在于是巰基引入步驟可能導致抗體中兩個fab區域會之間形成錯誤的二硫鍵，對后續偶聯造成影響。而隨機偶聯的方式則會導致異質性adc的產生。不同dar值的產品混雜會阻礙治療窗口的擴大。因此提高adc產品的均質性是目前adc構建中亟待解決的問題。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種用于雙特異抗體偶聯藥物的制備方法，本專利技術中
2、為達此目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，所述工程化雙特異抗體包括第一fab結構域，第二fab結構域，鉸鏈結構域和fc結構區域；
4、所述第二fab結構域包括tcr恒定結構域；
5、所述fc結構域包括kih突變。
6、本專利技術中，工程化雙特異抗體利用tcr恒定結構域將抗體fab結構域中的ch1/cl恒定結構域進行了替換，確保了同源hc-lc配對，并通過kih突變(“杵臼”技術)，可以確保了雙抗的異二聚體化。
7、優選地，所述鉸鏈區含有至少兩條鏈間二硫鍵。
8、優選地，所述kih突變的位點位于fc結構區域。
9、優選地，所述fc結構域含有第一ch2、第二ch2、第一ch3和第二ch3。
10、優選地，所述fc結構域中的第一ch3和第二ch3通過kih突變連接。
11、本專利技術中，kih突變為杵臼結構，是一種確保高異二聚化的機制。它指也可以選擇性地通過氨基酸工程改造產生空間效應從而有利于異二聚體形成而不利于同二聚體形成。具體結構為第一fc區，即包含抗體fab結構域的第一單體中的fc區，包含臼突變，第二fc區，即包含具有tcr恒定結構域替換的第二fab結構域的第二單體中的fc區，包含杵突變。這進一步增強了異二聚體化，避免兩個單體之間的錯配。
12、優選地，所述抗體靶向抗原包括her2、ang2、vegfra或trop2中任意一種或至少兩種的組合。
13、優選地，所述工程化雙特異抗體包括抗體a、抗體b或抗體c中的任意一種。
14、優選地，所述抗體a的第一重鏈的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。
15、seq?id?no:1：
16、evqlvesggglvqpggslrlscaasgytftnygmnwvrqapgkglewvgwintytgeptyaadfkrrftfsldtskstaylqmnslraedtavyycakyphyygsshwyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcreemtknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
17、優選地，所述抗體a的第一輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。
18、seq?id?no:2：
19、diqmtqspsslsasvgdrvtitcsasqdisnylnwyqqkpgkapkvliyftsslhsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqystvpwtfgqgtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec。
20、優選地，所述抗體a的第二重鏈的氨基酸序列如seq?id?no:3所示。
21、seq?id?no:3：
22、qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftgyymhwvrqapgqglewmgwinpnsggtnyaqkfqgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycarspnpyyydssgyyypgafdiwgqgtmvtvledlknvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgfypdhvelswwvngkevhsgvctdpqplkeqpalqdsryalssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgrasdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsreemtknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。
23、優選地，所述抗體a的第二輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
24、seq?id?no:4：
25、qpgltqppsvsvapgqtaritcggnnigsksvhwyqqkpgqapvlvvyddsdrpsgiperfsgsnsgntatl本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，其特征在于，所述工程化雙特異抗體包括第一Fab結構域，第二Fab結構域，鉸鏈結構域和Fc結構區域；
2.根據權利要求1所述的用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，其特征在于，所述鉸鏈區含有至少兩條鏈間二硫鍵；
3.根據權利要求1或2中所述的用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，其特征在于，所述工程化雙特異抗體包括抗體A、抗體B或抗體C中的任意一種。
4.根據權利要求3所述的用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，其特征在于，所述抗體A的第一重鏈的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；
5.一種偶聯物抗體比為4的抗體偶聯藥物，其特征在于，所述抗體偶聯藥物為權利要求1-4中任一項所述的一種用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體負載藥物。
6.根據權利要求5所述的偶聯物抗體比為4的抗體偶聯藥物，其特征在于，所述藥物包括紫杉醇、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、DM1、DM2、DM3、DM4、單甲基奧瑞他汀E、單甲基奧瑞他汀F、單甲基奧瑞他汀D、
7.一種根據權利要求5或6中所述的偶聯物抗體比為4的抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括將在工程化雙特異抗體中加入還原劑后和過渡金屬離子的鹽溶液后形成混合溶液進行靜置，加入螯合劑和藥物進行反應，純化后制得。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述混合溶液中工程化雙特異抗體的濃度為0.02-0.05mM；
9.根據權利要求7或8所述的制備方法，其特征在于，所述螯合劑包括乙二胺四乙酸和/或乙二醇四乙酸；
10.一種根據權利要求1-4中任一項所述的一種用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體或權利要求5或6中所述的偶聯物抗體比為4的抗體偶聯藥物在制備抗癌藥物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，其特征在于，所述工程化雙特異抗體包括第一fab結構域，第二fab結構域，鉸鏈結構域和fc結構區域；
2.根據權利要求1所述的用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，其特征在于，所述鉸鏈區含有至少兩條鏈間二硫鍵；
3.根據權利要求1或2中所述的用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，其特征在于，所述工程化雙特異抗體包括抗體a、抗體b或抗體c中的任意一種。
4.根據權利要求3所述的用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體，其特征在于，所述抗體a的第一重鏈的氨基酸序列如seq?id?no:1所示；
5.一種偶聯物抗體比為4的抗體偶聯藥物，其特征在于，所述抗體偶聯藥物為權利要求1-4中任一項所述的一種用于制備雙特異抗體偶聯藥物的工程化雙特異抗體負載藥物。
6.根據權利要求5所述的偶聯物抗體比為4的抗體偶聯藥物，其特征在于，所述藥...
【專利技術屬性】
技術研發人員：魏國光，張琳，范啟睿，
申請(專利權)人：上海藥明合聯生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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