【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞的誘導及培養。更具體地，涉及一種高效誘導調節性b細胞的體系、方法及其應用。
技術介紹
1、移植物抗宿主病(graft-versus-host?disease，gvhd)是造血干細胞移植后出現的多系統損害(皮膚、食管、胃腸，肝臟等)全身性疾病，是導致術后非復發死亡的主要原因。目前，臨床用藥主要依賴于糖皮質激素和免疫抑制劑，但是其治療效果不佳，長期使用會出現感染等不良反應。
2、近年來的研究發現，過繼性輸注具備免疫調節或再生性能的細胞可以有效的預防和治療gvhd。調節性b細胞(regulatory?b?cells，bregs)是一類具有免疫抑制能力的細胞，其可以抑制效應t細胞增殖及炎癥因子分泌，誘導調節性t細胞(regulatory?t?cells，tregs)產生，在自身免疫性疾病、感染及移植相關疾病中都發揮了免疫耐受的作用。另有研究發現，bregs與gvhd的疾病發生發展密切相關；造血干細胞移植后與未發病患者相比，gvhd患者外周血bregs的數量明顯降低；缺乏bregs顯著增加小鼠gvhd的嚴重程度；含有bregs的臍帶血與造血干細胞共同移植能夠有效地降低患者gvhd的發生率；gvhd患者治療后癥狀改善的同時伴隨著bregs比例的上升。而過繼性輸注小鼠bregs可以有效改善小鼠gvhd。因此，細胞治療可能是未來防治gvhd的有效手段。
3、b細胞在健康人外周血單個核細胞中僅占5～15％，bregs的占比則更少，人外周血中bregs占b細胞的比例不足1％，難以通過分離獲得滿足治療需求的b
技術實現思路
1、本專利技術針對上述技術的缺陷和不足，提供了一種高效誘導調節性b細胞的體系、方法及其應用。
2、本專利技術的第一個目的是提供一種用于誘導調節性b細胞的體系。
3、本專利技術的第二個目的是提供所述體系在誘導調節性b細胞或在制備用于誘導調節性b細胞的制劑中的應用。
4、本專利技術的第三個目的是提供一種體外誘導和分選cd19+cd1c+b細胞的方法。
5、本專利技術上述目的通過以下技術方案實現：
6、本專利技術針對調節性b細胞在外周血中比例較低，難以通過分離獲得滿足治療需求的調節性b細胞；b細胞體外擴增困難，易于凋亡；以及目前的誘導方案不能產生足夠數量的調節性b細胞，且促進il-10增加的同時也誘導了tnf-α的產生等問題，提供了一種用于誘導調節性b細胞的體系。利用本專利技術所述體系可以在高效誘導il-10+b細胞的同時降低其tnf-α的分泌。同時，本專利技術利用高維多色流式檢測誘導所得的調節性b細胞表型發現，誘導的調節性b細胞高表達cd1c，且與cd19+cd1c-b細胞相比，cd19+cd1c+b細胞表達更高水平的il-10，即利用本專利技術所述體系可以誘導獲得表達更高水平的il-10的調節性b細胞。此外，利用本專利技術所述體系誘導獲得的cd19+cd1c+b細胞可以抑制pbmc的增殖，降低效應t細胞炎癥因子的釋放，用于治療gvhd。因此，本專利技術請求保護所述誘導調節性b細胞的體系、方法及其應用。
7、本專利技術提供了一種用于誘導調節性b細胞的體系，所述體系包括基礎培養基和誘導物，所述誘導物包括cpg，還包括間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，msc)和/或chir-99021；所述cpg的序列如seq?id?no.1所示。
8、優選地，所述誘導物為cpg、間充質干細胞和chir-99021，見實施例1。當體系中同時存在誘導物cpg、間充質干細胞和chir-99021時，對調節性b細胞的誘導效果最好。
9、具體地，體系中cpg的終濃度為2～10μg/ml，chir-99021的終濃度為4～12μm，間充質干細胞與b細胞的數量比為1：3～8。
10、更具體地，體系中cpg的終濃度為3～5μg/ml，chir-99021的終濃度為5～10μm，間充質干細胞與b細胞的數量比為1：4～6。
11、更具體地，體系中cpg的終濃度為4μg/ml，chir-99021的終濃度為10μm，間充質干細胞與b細胞的數量比為1：5。
12、可選地，所述基礎培養基為rpmi-1640完全培養基。
13、具體地，所述調節性b細胞為表型為cd19+cd1c+的b細胞。
14、具體地，本專利技術誘導的調節性b細胞為人調節性b細胞。本專利技術經檢測發現，利用本專利技術所述體系誘導獲得的調節性b細胞主要富集于cd19+cd1c+b細胞，其表達il-10的能力與經典調節性b細胞cd24+cd27+b細胞相當，但cd19+cd1c+b細胞占cd19+b細胞的比例顯著高于cd24+cd27+b細胞，即利用本專利技術所述體系可以誘導獲得更多的調節性b細胞，大大提高了調節性b細胞的產生效率，誘導效率更高。本專利技術還請求保護所述體系在誘導調節性b細胞或在制備用于誘導調節性b細胞的制劑中的應用。
15、具體地，所述調節性b細胞為表型為cd19+cd1c+的b細胞。
16、本專利技術還提供了一種體外誘導和分選cd19+cd1c+b細胞的方法，所述方法為：將待誘導培養的cd19+b細胞置于所述體系中誘導培養36～48h，以cd1c為表面標志物分選得到cd19+cd1c+b細胞。
17、具體地，當體系中的誘導物含間充質干細胞時，需提前一天消化間充質干細胞，按70％的密度將間充質干細胞種于孔板中，過夜貼壁。
18、具體地，培養條件為35～38℃、5％co2。
19、具體地，通過流式細胞術分選得到cd19+cd1c+b細胞。
20、本專利技術具有以下有益效果：
21、本專利技術提供了一種用于誘導調節性b細胞的體系，其可以在促進b細胞表達il-10的同時減少炎癥因子tnf-α的產生。在此基礎上，本專利技術還提供了一種利用所述體系誘導獲得調節性b細胞的方法。本專利技術利用高維多色流式檢測誘導的調節性b細胞表型，發現誘導的調節性b細胞高表達cd1c，且與cd19+cd1c-b細胞相比，cd19+cd1c+b細胞表達更高水平的il-10。此外，本專利技術將cd19+cd1c-b細胞與外周血單個核細胞和效應t細胞分別共培養，發現其在體外能有效抑制外周血單個核細胞的增殖，減少效應t細胞分泌促炎因子tnf-α和ifn-γ。進一步構建人源化小鼠gvhd模型，發現輸注cd19+cd1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于誘導調節性B細胞的體系，其特征在于，所述體系包括基礎培養基和誘導物，所述誘導物包括CpG，還包括間充質干細胞和/或CHIR-99021；所述CpG的序列如SEQ?IDNO.1所示。
2.根據權利要求1所述體系，其特征在于，所述誘導物為CpG、間充質干細胞和CHIR-99021。
3.根據權利要求1或2所述體系，其特征在于，體系中CpG的終濃度為2～10μg/mL，CHIR-99021的終濃度為4～12μM，間充質干細胞與B細胞的數量比為1：3～8。
4.根據權利要求1或2所述體系，其特征在于，所述基礎培養基為RPMI-1640完全培養基。
5.根據權利要求1或2所述體系，其特征在于，所述調節性B細胞為表型為CD19+CD1c+的B細胞。
6.權利要求1或2所述體系在誘導調節性B細胞或在制備用于誘導調節性B細胞的制劑中的應用。
7.根據權利要求6所述應用，其特征在于，所述調節性B細胞為表型為CD19+CD1c+的B細胞。
8.一種體外誘導和分選CD19+CD1c+B細胞的方法，其特征在于
9.根據權利要求8所述方法，其特征在于，培養條件為35～38℃、5％CO2。
10.根據權利要求8所述方法，其特征在于，通過流式細胞術分選得到CD19+CD1c+B細胞。
...【技術特征摘要】
1.一種用于誘導調節性b細胞的體系，其特征在于，所述體系包括基礎培養基和誘導物，所述誘導物包括cpg，還包括間充質干細胞和/或chir-99021；所述cpg的序列如seq?idno.1所示。
2.根據權利要求1所述體系，其特征在于，所述誘導物為cpg、間充質干細胞和chir-99021。
3.根據權利要求1或2所述體系，其特征在于，體系中cpg的終濃度為2～10μg/ml，chir-99021的終濃度為4～12μm，間充質干細胞與b細胞的數量比為1：3～8。
4.根據權利要求1或2所述體系，其特征在于，所述基礎培養基為rpmi-1640完全培養基。
5.根據權利要求1或2所述體系，其特征在于，所述調節性b細胞...
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