【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及一種靶向nectin-4的納米抗體、嵌合抗原受體car及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、嵌合抗原受體t細(xì)胞(car-t)治療在血液腫瘤中顯示出了顯著的治療效果。然而，由于復(fù)雜的抑制性腫瘤微環(huán)境、靶標(biāo)缺陷、缺乏特異性抗原、遞送不力和抗原的持續(xù)刺激導(dǎo)致t細(xì)胞耗竭，目前將car-t細(xì)胞應(yīng)用于實體腫瘤治療仍然是一個挑戰(zhàn)。
2、大多數(shù)候選靶抗原通常在非惡性組織上共同表達(dá)，缺乏高度腫瘤特異性的細(xì)胞表面靶點，會造成低腫瘤外/靶上毒性的風(fēng)險。脊髓灰質(zhì)炎病毒受體4(nectin-4)是一種獨(dú)立于ca2+的免疫球蛋白樣蛋白，主要參與細(xì)胞-細(xì)胞粘附。它多在胎盤和胚胎組織中表達(dá)，在成人健康組織和血清中很少表達(dá)。但在一些腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，如尿路上皮癌、乳腺癌、皮膚癌、胃癌、食管癌、宮頸癌、前列腺癌等多種癌癥。鑒于nectin-4在正常人體組織中表達(dá)有限，而在部分實體腫瘤中過表達(dá)，nectin-4作為一種新的治療實體腫瘤的靶點備受關(guān)注。
3、納米抗體(nanobody,nb)是一種人工設(shè)計的抗體分子，又稱為單域抗體(single-domain?antibodies,sdabs)、vhh抗體或camelid抗體。1993年，比利時的科學(xué)家在駱駝的血清中發(fā)現(xiàn)了一種天然輕鏈缺失的重鏈抗體，分子量約95kda，其中包括兩個恒定區(qū)(ch2和ch3)、一個鉸鏈區(qū)和一個重鏈可變區(qū)(variable?heavy?chain?domain,vhh)，接著克隆得到只包含一個重鏈可變區(qū)的單域抗體，即vhh抗體。vhh抗體的晶體結(jié)構(gòu)為
4、納米抗體分子量僅為傳統(tǒng)抗體的10％，保留了hcabs完整的抗原結(jié)合能力，特異性強(qiáng)、親和性好、穩(wěn)定性高，廣泛用于生化機(jī)制研究、結(jié)構(gòu)生物學(xué)及腫瘤等疾病診療。現(xiàn)有技術(shù)中已開發(fā)的靶向的單克隆抗體多為單鏈抗體，單鏈抗體包含重鏈和輕鏈，雖然單鏈抗體相比于傳統(tǒng)抗體，具有分子量小、穿透力強(qiáng)和抗原性弱等特點。但是納米抗體相比單鏈抗體，具有更高的溶解度、穩(wěn)定性、更小的尺寸和更低的生產(chǎn)成本等優(yōu)異的化學(xué)和物理特性。
5、car-t細(xì)胞的遷移和持續(xù)存在是腫瘤患者持久臨床反應(yīng)的必要因素。t細(xì)胞向腫瘤團(tuán)塊的主動轉(zhuǎn)運(yùn)部分取決于腫瘤中的趨化因子與t細(xì)胞上呈現(xiàn)的趨化因子受體之間的相容性，因此不匹配的腫瘤誘導(dǎo)的趨化因子/趨化因子受體被認(rèn)為是限制t細(xì)胞浸潤的關(guān)鍵因素之一。il-8是一個趨化因子，參與形成腫瘤微環(huán)境的免疫抑制環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞間充質(zhì)化和血管形成，增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移能力。是抗腫瘤治療的一大障礙。cxcr1和cxcr2為il8受體，利用腫瘤產(chǎn)生的il-8來引導(dǎo)il-8受體修飾的car-t細(xì)胞遷移到腫瘤中，并在實體腫瘤中誘導(dǎo)增強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)。
6、此外，腸道微生物群已被證明直接影響特異性癌癥免疫治療的療效。醋酸、丙酸和丁酸是主要的腸道微生物代謝物，屬于短鏈脂肪酸(scfas)類，有研究表明短鏈脂肪酸可以促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)增，也能改善效應(yīng)t細(xì)胞的功能。但短鏈脂肪酸能否直接影響car-t細(xì)胞對實體腫瘤的治療效果暫無明確報道。
7、因此，將微生物短鏈脂肪酸與cxcr1修飾的car-t細(xì)胞聯(lián)合，創(chuàng)新和開發(fā)新的car-t細(xì)胞藥物、提高靶向nectin-4的car-t細(xì)胞的浸潤和抗腫瘤活性、對于提高臨床療效具有重要意義和廣泛的應(yīng)用價值。為晚期腫瘤患者，特別是三陰性乳腺癌患者提供治療選擇，促進(jìn)car-t細(xì)胞的商業(yè)化進(jìn)程，讓更多患者受益。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是克服car-t細(xì)胞在實體腫瘤中療效不佳的技術(shù)缺陷，提供一種微生物短鏈脂肪酸處理且cxcr1修飾的靶向nectin-4的car-t細(xì)胞，并證明了其治療效果。盡管本專利技術(shù)專利以殺傷乳腺癌細(xì)胞為例，該藥物同樣適用于表達(dá)nectin-4的其他腫瘤類型，例如尿路上皮癌、乳腺癌、皮膚癌、胃癌、食管癌、宮頸癌、前列腺癌等。
2、本專利技術(shù)的第一個目的是提供一種靶向nectin-4的納米抗體，所述靶向necti?n-4的納米抗體包括互補(bǔ)決定區(qū)，所述互補(bǔ)決定區(qū)由cdr1、cdr2和cdr3組成；所述cdr1的氨基酸序列為seq?id?no.2所示；所述cdr2的氨基酸序列為seq?id?no.3所示；所述cdr3的氨基酸序列為seq?id?no.4所示。
3、seq?id?no.2：ptfniya；
4、seq?id?no.3：lvlvvp；
5、seq?id?no.4：vrgiyye；
6、進(jìn)一步的，所述靶向nectin-4的納米抗體還包括框架區(qū)fr1、fr2、fr3和fr4；所述fr1的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；所述fr2的氨基酸序列如seq?id?no.6所示；所述fr3的氨基酸序列如seq?id?no.7所示；所述fr4的氨基酸序列如seq?id?no.8所示。
7、seq?id?no.5序列為：gvtlvesggalvkpggslkiscaasg；
8、seq?id?no.6序列為：mswvrqtpekrlewvas；
9、seq?id?no.7序列為：
10、lsrqcedrftisrdsarnilylqmnslrsedtamyyc；
11、seq?id?no.8序列為：ywgqgttltvss。
12、進(jìn)一步的，所述抗體的氨基酸全長序列如seq?id?no.1所示。
13、seq?id?no.1序列為：
14、gvtlvesggalvkpggslkiscaasgptfniyamswvrqtpekrlewvas?lvlvvplsrqcedrftisrdsarnilylqmnslrsedtamyycvrgiyyeyw?gqgttltvss。
15、本專利技術(shù)的第二個目的是提供一種分離的核酸，所述核酸包括編碼上述靶向nectin-4的納米抗體的核酸序列或其互補(bǔ)序列。其核酸序列為seq?id?no.9：ggagtgacactggtggagtcggggggagccttagtgaagcctggagggtccctgaagatctcttgtgcagcctctggacccactttcaatatctatgccatgtcttgggttcgccagactccagagaagaggctggagtgggtcgcatccattggtacttgtggtcccacctattatccagacagtgtgaagatcgattcaccatctccagagatagtgccaggaacatcctgtatctgcaaatgaacagtctgaggtctgaagacacggccatgtattactgtgtaagaggcatctactatgagactactg本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種靶向Nectin-4的納米抗體，其特征在于：所述納米抗體包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括CDR1、CDR2和CDR3組成的三個互補(bǔ)決定區(qū)，CDR1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向Nectin-4的納米抗體，其特征在于：所述納米抗體還包括框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4；所述FR1的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.5所示；所述FR2的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.6所示；所述FR3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。
3.如權(quán)利要求1所述的靶向Nectin-4的納米抗體，其特征在于：所述納米抗體的氨基酸全長序列如SEQ?ID?NO.1所示。
4.一種分離的核酸，其特征在于，所述核酸包括編碼權(quán)利要求1～3任一項所述的納米抗體的核酸序列或其互補(bǔ)序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8所示。
6.一種包含如權(quán)利要求5所述的分離
7.一種包含權(quán)利要求1～3任一項所述的納米抗體的嵌合抗原受體CAR，其特征在于：所述納米抗體作為嵌合抗原受體CAR的抗原識別結(jié)構(gòu)域，與鉸鏈結(jié)構(gòu)域組成胞外結(jié)構(gòu)域，所述嵌合抗原受體CAR還包括跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和共表達(dá)的CXCR1趨化因子受體；所述胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括共刺激結(jié)構(gòu)域和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合抗原受體CAR，其特征在于：所述跨膜結(jié)構(gòu)域選自CD3ζ、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、ICOS、CD134、CD137、CD154、NKG2D、2B4和DNAM1中的一種或多種的跨膜結(jié)構(gòu)域；所述共刺激結(jié)構(gòu)域選自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、DAP10、DAP12、NKp44、NKG2D、NKp46，NKp30、TNFR家族或SLAM相關(guān)受體家族例如2B4中的一種或多種組合，其中，TNFR家族指的是4-1BB、OX40和CD27中的任意一種；所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域為CD3ζ。
9.一種表達(dá)權(quán)利要求7所述的嵌合抗原受體CAR的CAR-T細(xì)胞，或提供一種表達(dá)權(quán)利要求7所述嵌合抗原受體且經(jīng)短鏈脂肪酸處理的增強(qiáng)型CAR-T細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1～3任意一項所述的納米抗體、權(quán)利要求7所述的嵌合抗原受體CAR、權(quán)利要求9所述的CAR-T細(xì)胞或增強(qiáng)型CAR-T細(xì)胞在抗Nectin-4(+)癌細(xì)胞的活性藥品或產(chǎn)品中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種靶向nectin-4的納米抗體，其特征在于：所述納米抗體包括重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括cdr1、cdr2和cdr3組成的三個互補(bǔ)決定區(qū)，cdr1的氨基酸序列如seq?id?no.2所示、cdr2的氨基酸序列如seq?id?no.3所示、cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的靶向nectin-4的納米抗體，其特征在于：所述納米抗體還包括框架區(qū)fr1、fr2、fr3和fr4；所述fr1的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；所述fr2的氨基酸序列如seq?id?no.6所示；所述fr3的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。
3.如權(quán)利要求1所述的靶向nectin-4的納米抗體，其特征在于：所述納米抗體的氨基酸全長序列如seq?id?no.1所示。
4.一種分離的核酸，其特征在于，所述核酸包括編碼權(quán)利要求1～3任一項所述的納米抗體的核酸序列或其互補(bǔ)序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸，其特征在于：其核苷酸序列如seq?id?no.8所示。
6.一種包含如權(quán)利要求5所述的分離的核酸的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。
7.一種包含權(quán)利要求1～3任一項所述的納米抗體的嵌合抗原受體car，其特征在于：所述納米抗體作為嵌合抗原受體car的抗原識別結(jié)構(gòu)域，與鉸鏈結(jié)構(gòu)域組成胞外結(jié)構(gòu)域，所述嵌合抗原受體car還包括跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和共表達(dá)的cxcr1趨...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何偉杰，徐振宇，何連君，邵慧敏，錢學(xué)藝，伍耀，
申請(專利權(quán))人：皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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