【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學工程領域，具體涉及一種慢病毒轉染增強納米顆粒及其制備方法與應用。
技術介紹
1、公開該
技術介紹
部分的信息僅僅旨在增加對本專利技術的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
2、生物學及生物醫學等研究領域常使用慢病毒對細胞進行基因編輯，以實現目標基因的敲除、過表達或重組等目標。然而，由于細胞膜的天然屏障作用及其表面負電位的狀態，負電性的慢病毒往往難以自主通過細胞膜。目前，多采用將慢病毒裝載至具有細胞膜穿透作用的納米顆粒上，以提升慢病毒轉染效率。
3、慢病毒轉染增強納米顆粒的基本原理是通過納米顆粒的物理特性，提高慢病毒在靶細胞中的轉染效率。這些納米顆粒能夠富集病毒顆粒在細胞表面，增加病毒與細胞的接觸機會，進而促進病毒感染細胞，從而為基因編輯提供有力支持。慢病毒轉染增強納米顆粒主要包括聚合物納米顆粒、脂質納米載體、蛋白質復合物、細胞穿透肽納米載體等。
4、雖然目前已有許多商業化的慢病毒轉染增強納米顆粒，如聚凝胺，但是對一些細胞膜流動性較差或生長周期較長的組織或細胞(如，成骨細胞和骨組織等)，現有的慢病毒轉染增強納米顆粒仍然難以實現較高的轉染效率，這極大影響基因編輯進程。同時聚凝胺還存在生物毒性大的問題。因此，研發一種適用范圍更廣、轉染效率更高、生物毒性更小的慢病毒轉染增強納米顆粒是目前基因編輯和納米材料領域中亟待解決的問題。
技術實現思路
1、為了解決現有技術的不足，
2、為了實現上述目的，本專利技術的技術方案為：
3、本專利技術的第一個方面，提供一種納米顆粒，所述納米顆粒由聚乙二醇(polyethylene?glycol，peg)和亞精胺(spermidine)通過自組裝制備而成。
4、對于成骨細胞等細胞膜流動性較低或生長周期較長的特定細胞群體，目前商業化的慢病毒轉染增強納米顆粒普遍存在轉染效率較低的問題，即單位作用時間內感染的細胞數量有限，這導致了慢病毒轉染后繁瑣冗長的細胞連續傳代和篩選等工作。針對這一問題，本專利技術創新性地提出使用具有表面活性劑作用的帶陰離子的大分子聚乙二醇和具有誘導細胞吞噬增強作用的帶陽離子的小分子亞精胺作為制備慢病毒轉染增強納米顆粒的原材料，通過靜電吸附和低溫低速自組裝制備粒徑均一且分散度高的納米顆粒；利用聚乙二醇的親水性保證納米顆粒的水溶性和穩定性；利用亞精胺誘導細胞生理性自噬和胞吞作用增強慢病毒轉染效率。本專利技術經大量試驗表明，相比于目前常用的多款商業化的慢病毒轉染增強納米顆粒，聚乙二醇-亞精胺納米顆粒在單位時間內將慢病毒轉染效率提升80％，且連續轉染的穩定性提升5倍。
5、雖然聚乙二醇和亞精胺均具有較高的生物相容性，但當其作為納米顆粒的組成成分進入細胞內時，難免會引發細胞內一系列的應激反應。尤其是聚乙二醇作為一種生物惰性的大分子，常常誘發細胞內的免疫排斥反應發生。為了保證轉染進入細胞的慢病毒的實際作用效果，需要將納米顆粒對細胞的影響盡可能降至最低，以減少對基因編輯效果的干擾。本專利技術首次提出了使用亞精胺作為聚乙二醇細胞內免疫排斥反應的“舒緩劑”，利用亞精胺作為天然多胺的抗氧化作用適度減輕細胞內由聚乙二醇導致的氧化應激水平升高；利用亞精胺促進生理性自噬加速細胞內聚乙二醇的排出。同時，由于亞精胺是小分子活性物質，參與多種細胞內代謝活動，在進入細胞后數小時后即可完全代謝轉化，不會影響基因編輯效果和目標基因作用效果等后續細胞實驗的正常開展。
6、在本專利技術的一些實施例中，所述聚乙二醇的分子量為4000-8000。
7、在本專利技術的一些實施例中，所述納米顆粒的粒徑為200-250nm。
8、本專利技術的第二個方面，提供一種上述的納米顆粒的制備方法，包括：
9、將聚乙二醇和亞精胺溶于水中，得到混合溶液；
10、將所述混合溶液在0-5℃、100-300rpm條件下攪拌1-3h，離心，得到納米顆粒。
11、在本專利技術的一些實施例中，所述混合溶液中，聚乙二醇的濃度為1-20mg/ml，亞精胺的濃度為0.5-10μm。
12、雖然聚乙二醇具有較高的親水性，但當其與陽離子發生親和吸附時往往會由于聚合速率過快導致沉降，從而影響制備納米顆粒的均一性和穩定性。本專利技術經過大量試驗證明，采用低溫低速自組裝的方法，即反應溫度為0-5℃、攪拌轉速為100-300rpm，尤其是在反應溫度為4℃、攪拌轉速200rpm條件下，可有效控制聚乙二醇和亞精胺的聚合速率，進而制備粒徑均一、分散度高、長期穩定的納米顆粒。
13、本專利技術所提供的基于聚乙二醇和亞精胺合成制備的納米顆粒對細胞膜流動性較低和生長周期較長的組織或細胞(如，成骨細胞和骨組織)有極高的結合力和穿透力，能夠顯著增強所攜帶的慢病毒的轉染效率。因此，本專利技術的第三個方面，提供一種上述的納米顆粒或上述的制備方法制備的納米顆粒在制備提高慢病毒轉染效率的產品中的應用。
14、在本專利技術的一些實施例中，所述產品為用于提高慢病毒轉染效率的試劑盒、轉染增強劑或載體。
15、在本專利技術的一些實施例中，所述產品用于細胞膜流動性差的細胞或組織的慢病毒轉染；和/或生長周期長的細胞或組織的慢病毒轉染。
16、在本專利技術的一些實施例中，所述細胞或組織為成骨細胞和骨組織。
17、本專利技術的第四個方面，提供一種提高慢病毒轉染效率的方法，采用上述的納米顆粒或上述的制備方法制備的納米顆粒裝載慢病毒，并對目標樣本在體外實驗中進行基因轉染。
18、在本專利技術的一些實施例中，所述目標樣本包括細胞膜流動性差或生長周期長的組織或細胞。
19、優選的，所述目標樣本為成骨細胞或骨組織樣本。
20、本專利技術的第五個方面，提供一種慢病毒轉染增強納米顆粒，其為裝載有慢病毒的納米顆粒；
21、所述慢病毒轉染增強納米顆粒中，納米顆粒的滴度為900-1100tu，慢病毒的滴度為≤106tu；
22、所述納米顆粒為上述的納米顆粒或上述的制備方法制備的納米顆粒。
23、本專利技術所提供的慢病毒轉染增強納米顆粒的生物相容性很高，無細胞毒性，且制備方法簡單高效，尤其是能夠顯著提升慢病毒對細胞膜流動性較低或生長周期較長的細胞轉染效率，從而極大提升基因編輯效果。
24、在本專利技術的一些實施例中，所述慢病毒轉染增強納米顆粒的粒徑為300-350nm。
25、在本專利技術的一些實施例中，所述慢病毒為過表達aldh6a1的慢病毒。
26、本專利技術的第六個方面，提供一種上述的慢病毒轉染增強納米顆粒的制備方法，包括：
27、將慢病毒與上述的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒由聚乙二醇和亞精胺通過自組裝制備而成。
2.如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量為4000-8000；
3.一種權利要求1-2任一所述的納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括：
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述混合溶液中，聚乙二醇的濃度為1-20mg/mL，亞精胺的濃度為0.5-10μM。
5.一種權利要求1-2任一所述的納米顆粒或權利要求3或4所述的制備方法制備的納米顆粒在制備提高慢病毒轉染效率的產品中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述產品為用于提高慢病毒轉染效率的試劑盒、轉染增強劑或載體；
7.一種提高慢病毒轉染效率的方法，其特征在于，采用權利要求1-2任一所述的納米顆粒或權利要求3或4所述的制備方法制備的納米顆粒裝載慢病毒，并對目標樣本在體外實驗中進行基因轉染；
8.一種慢病毒轉染增強納米顆粒，其特征在于，其為裝載有慢病毒的納米顆粒；
9.一種權利要求8所述的慢病毒轉染增強納米顆粒
10.一種權利要求8所述的慢病毒轉染增強納米顆粒在制備慢病毒轉染產品中的應用；
...【技術特征摘要】
1.一種納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒由聚乙二醇和亞精胺通過自組裝制備而成。
2.如權利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量為4000-8000；
3.一種權利要求1-2任一所述的納米顆粒的制備方法，其特征在于，包括：
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述混合溶液中，聚乙二醇的濃度為1-20mg/ml，亞精胺的濃度為0.5-10μm。
5.一種權利要求1-2任一所述的納米顆粒或權利要求3或4所述的制備方法制備的納米顆粒在制備提高慢病毒轉染效率的產品中的應用。
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【專利技術屬性】
技術研發人員：王亞楠，劉世岳，葛少華，張東姣，于璐，王婷，
申請(專利權)人：山東大學，
類型：發明
國別省市：
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