【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于多肽藥物的純化，具體涉及一種替爾泊肽的純化方法。
技術(shù)介紹
1、替爾泊肽(tirzepatide)的氨基酸序列如下：
2、tyr-{aib}-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-ile-{aib}-leu-asp-lys-ile-ala-gln-{diacid-c20-gamma-glu-(aeea)2-lys}-ala-phe-val-gln-trp-leu-ile-ala-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2，替爾泊肽是一種葡萄糖依賴性促胰島素多肽（gip）和胰高血糖素樣肽-1（glp-1）受體雙重激動(dòng)劑。通過激活這兩種受體，可以調(diào)節(jié)血糖水平，增加胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，延緩胃排空，從而減少食物攝入和降低體重。原研公司為美國(guó)禮來，主要適應(yīng)癥為治療2型糖尿病以及減肥。其是fda批準(zhǔn)的第一個(gè)gip/glp雙受體激動(dòng)劑，尤其在減肥領(lǐng)域上有著堪比切胃手術(shù)的功效，受眾市場(chǎng)極其廣大，也可以改善當(dāng)下普遍的肥胖亞健康的現(xiàn)狀。
3、由于替爾泊肽中包含非天然氨基酸，只能通過人工合成的方法得到產(chǎn)品。其中合成的方法包括全固相合成和固液結(jié)合合成的方式。但是兩種合成方式得到的粗品種，均會(huì)存在與主產(chǎn)品結(jié)構(gòu)相似的消旋雜質(zhì)、缺失肽、差向肽、脫酰胺化等難移除雜質(zhì)。很多相關(guān)結(jié)構(gòu)雜質(zhì)不但沒有藥物療效，反而具有毒副作用。藥品臨床使用中的不良反應(yīng)除了與藥品本身的藥理活性有關(guān)外，有時(shí)還與藥品中的雜質(zhì)有關(guān)，須嚴(yán)格控制。如葡萄糖輸液中的
4、目前開發(fā)了眾多用于替爾泊肽的純化方法，例如cn?117736273b雖然公開了一種替爾泊肽的純化方法，其需要三次純化才能得到高品質(zhì)的產(chǎn)品，且每次純化周期均超過60分鐘，造成大量有機(jī)廢溶劑的產(chǎn)生，成本高居不下且不適應(yīng)環(huán)保的長(zhǎng)期發(fā)展，且產(chǎn)品總回收率低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的替爾泊肽粗品純化周期長(zhǎng)、成本高、不環(huán)保、純度低、產(chǎn)品總回收率低等難題，本專利技術(shù)提供了一種替爾泊肽的純化方法，其純化周期短、效率高、能夠得到單雜小于0.1%的高純度產(chǎn)品、純化總回收率高，純化成本低且能夠?qū)崿F(xiàn)綠色可持續(xù)發(fā)展。
2、本專利技術(shù)提供了一種替爾泊肽的純化方法，所述純化方法包括以下步驟：
3、(a)替爾泊肽粗品原料溶解于乙腈水溶液中，得到替爾泊肽粗品溶液；
4、(b)對(duì)所述替爾泊肽粗品溶液進(jìn)行第一次純化，
5、第一固定相為反相填料；
6、第一流動(dòng)相a為磷酸水溶液，所述磷酸水溶液的體積濃度為0.2%~0.4%，并加入四丁基硫酸氫銨或三乙胺調(diào)節(jié)ph至2~4；
7、第一流動(dòng)相b為乙腈與異丙醇的體積比為3:1的混合溶液；
8、洗脫梯度為所述第一流動(dòng)相a的體積百分比為61%~52%，所述第一流動(dòng)相b的體積百分比為39%~48%，進(jìn)行線性梯度洗脫35~40分鐘，收集純度大于97%、單雜小于1.5%的餾分作為第一餾分；
9、(c)對(duì)所述第一餾分進(jìn)行第二次純化，
10、第二固定相為反相填料；
11、第二流動(dòng)相a為碳酸氫銨溶液，所述碳酸氫銨的濃度為50~100mm；
12、第二流動(dòng)相b為乙腈；
13、洗脫梯度為所述第二流動(dòng)相a的體積百分比為65%～60%，所述第二流動(dòng)相b的體積百分比為35%～40%，進(jìn)行線性梯度洗脫35~40分鐘，收集純度大于99.5%、單雜小于0.1%的餾分作為第二餾分；
14、(d)對(duì)所述第二餾分進(jìn)行納濾濃縮、換鹽、過濾除菌得到凍干前溶液，將所述凍干前溶液凍干，得到替爾泊肽。
15、優(yōu)選地，所述步驟(a）中，所述替爾泊肽粗品原料溶解于體積濃度為20~40%的乙腈水溶液中，攪拌4小時(shí)，過濾得到所述替爾泊肽粗品溶液。
16、優(yōu)選地，所述步驟(a)中，所述乙腈水溶液的溶度為30%。
17、優(yōu)選地，所述步驟(b)中所述第一流動(dòng)相a為體積濃度為0.3%的磷酸水溶液，ph為3.0。
18、優(yōu)選地，所述步驟(c)中所述第二流動(dòng)相a為100mm的碳酸氫銨溶液。
19、優(yōu)選地，所述第一反相填料和所述第二反相填料分別獨(dú)立地選自四烷基硅烷鍵合硅膠填料、八烷基硅烷鍵合硅膠填料、十八烷基硅烷鍵合硅膠填料中的任意一種。
20、優(yōu)選地，所述第一反相填料和所述第二反相填料均為十八烷基硅烷鍵合硅膠填料，所述步驟（b）中所述第一流動(dòng)相a為體積濃度為0.3%的磷酸水，并加入四丁基硫酸氫銨調(diào)節(jié)ph至3.0，所述步驟（c）中所述第二流動(dòng)相a為濃度為100mm的碳酸氫銨溶液。
21、優(yōu)選地，所述凍干前溶液的濃度為70~100mg/g，所述凍干前溶液的高度不超過1.5cm。
22、優(yōu)選地，在所述步驟(b)中，按照以下參數(shù)進(jìn)行線性梯度洗脫40分鐘：
23、,
24、在所述步驟（c）中，按照以下參數(shù)進(jìn)行線性梯度洗脫35分鐘：
25、。
26、優(yōu)選地，在所述步驟(b)中，所述第一次純化按照以下參數(shù)進(jìn)行：
27、，
28、在所述步驟（c）中，所述第二次純化按照以下參數(shù)進(jìn)行：
29、。
30、本專利技術(shù)的純化方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：
31、1）在用于溶解替爾泊肽粗品原料的溶劑中適當(dāng)加入乙腈，可以加速色氨酸脫酸反應(yīng)的完全進(jìn)行，利于純化分離及回收率的提高。且替爾泊肽粗品原料的溶解性更佳，濃度可高達(dá)50g/l。得到的溶液為酸性，穩(wěn)定性好，解決了大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，粗品溶液溶劑量大且純化周期長(zhǎng)導(dǎo)致粗品溶液變質(zhì)的問題。
32、2）本專利技術(shù)的純化方法中兩次純化采用酸、堿互補(bǔ)的方式，能夠有效去除不同性質(zhì)下分離度有差異的雜質(zhì)，且能有效分離距離主峰較近的去酰胺化雜質(zhì)及消旋雜質(zhì)。并且通過對(duì)不同流動(dòng)相的選擇以及洗脫梯度的優(yōu)化，提高了產(chǎn)品的回收率以及純度，能夠得到單雜小于0.1%的高純度產(chǎn)品。
33、3）本專利技術(shù)通過四丁基硫酸氫銨或三乙胺調(diào)節(jié)流動(dòng)相的ph，四丁基硫酸氫銨作為離子對(duì)試劑與樣品中的陰離子形成離子對(duì)，這種離子對(duì)的形成改變了樣品的保留行為和在流動(dòng)相中的分布狀態(tài)。同時(shí)，四丁基硫酸氫銨可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，使流動(dòng)相的極性更適合樣品的分離，減少樣品分子與固定相之間的非特異性吸附，使樣品分子在色譜柱中有更合適的保留和洗脫行為。四丁基硫酸氫銨可以與硅醇基發(fā)生反應(yīng)，降低硅醇基的活性，從而減少堿性樣品的拖尾現(xiàn)象。三乙胺能夠屏蔽填料中的硅醇基，減少樣品分子與固定相中硅醇基的相互作用，顯著改善峰形，消除拖尾現(xiàn)象。
34、4）相比普遍的100分鐘每針的純化周期，本專利技術(shù)純化方法的洗脫周期只有35~40分鐘，大大縮短了純化周期，且大幅減少替爾泊肽純化過程中有機(jī)溶劑本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種替爾泊肽的純化方法，其特征在于，所述純化方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(a）中，所述替爾泊肽粗品原料溶解于體積濃度為20~40%的乙腈水溶液中，攪拌4小時(shí)，過濾得到所述替爾泊肽粗品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化，方法，其特征在于，所述步驟(a)中，所述乙腈水溶液的溶度為30%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(b)中所述第一流動(dòng)相A為體積濃度為0.3%的磷酸水溶液，pH為3.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(c)中所述第二流動(dòng)相A為100mM的碳酸氫銨溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述第一反相填料和所述第二反相填料分別獨(dú)立地選自四烷基硅烷鍵合硅膠填料、八烷基硅烷鍵合硅膠填料、十八烷基硅烷鍵合硅膠填料中的任意一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的純化方法，其特征在于，所述第一反相填料和所述第二反相填料均為十八烷基硅烷鍵合硅膠填料，所述步驟（b）中所述第一流動(dòng)相A為體積濃度為0.3%的磷
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述凍干前溶液的濃度為70~100mg/g，所述凍干前溶液的高度不超過1.5cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，按照以下參數(shù)進(jìn)行線性梯度洗脫40分鐘：
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的純化方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，所述第一次純化按照以下參數(shù)進(jìn)行：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種替爾泊肽的純化方法，其特征在于，所述純化方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(a）中，所述替爾泊肽粗品原料溶解于體積濃度為20~40%的乙腈水溶液中，攪拌4小時(shí)，過濾得到所述替爾泊肽粗品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化，方法，其特征在于，所述步驟(a)中，所述乙腈水溶液的溶度為30%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(b)中所述第一流動(dòng)相a為體積濃度為0.3%的磷酸水溶液，ph為3.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述步驟(c)中所述第二流動(dòng)相a為100mm的碳酸氫銨溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述第一反相填料和所述第二反相填料分別獨(dú)立地選自四烷基硅烷鍵合...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：何志泉，楊麗香，許金行，田茂奎，陳程云，潘德林，董巖，岳丹丹，李丹，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：福建基諾厚普生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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