【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及用于改進測定比如多重免疫pcr測定的化合物、組合物和方法。
技術介紹
1、靶標分子(比如蛋白)的免疫測定一般地依賴于成對的分子識別元件(比如抗體或適體)來首先捕獲并然后標記靶標分子使得可對其進行量化。一般地，捕獲抗體結合于固體支持物，比如微孔板的壁或微珠的表面。樣品與抗體包被的表面一起溫育以捕獲靶標分子。在去除樣品基質的洗滌步驟之后，將捕獲的靶標分子用檢測識別元件(比如抗體或適體)標記，該元件可直接綴合于報告分子(標簽)或連接試劑(比如生物素)，其允許隨后偶聯于標簽。或者，檢測識別元件可用第二抗體進行檢測，第二抗體又通過標簽來檢測。標簽可包括可通過直接觀察或通過化學或生化測定檢測的納米顆粒、染料、酶或核酸(na)。
2、在不需要高靈敏度的應用中，標簽可為金納米顆粒(在側流式測定中受歡迎)或者可直接檢測的熒光染料。luminex?corp.已將一種使用直接標記的受歡迎的免疫測定商業化。在該測定中，編碼的微珠組用于進行多重免疫測定。通過用獨特的染料組合對珠粒進行染色對每個珠粒組進行編碼。然后用不同的親和試劑(例如抗體、抗原等)將每個珠粒組功能化。珠粒可混合在一起以形成多重珠粒庫。在測定期間，將珠粒與樣品一起溫育以如果存在靶標的話則捕獲靶標分子。洗滌珠粒并然后與檢測抗體一起溫育，該檢測抗體用報告染料標記或生物素化，使得其隨后可用鏈霉親和素綴合的報告染料標記。流式細胞術或熒光顯微術用于確定編碼染料(以鑒定珠粒類型)的組合和每種珠粒的測定信號(即來自報告染料的信號)兩者。通過將每種珠粒類型的平均測得測定信號與標準
3、酶聯免疫吸附測定(elisa)為一種眾所周知的免疫測定，其使用信號放大來提高測定靈敏度。elisa使用親和試劑對來捕獲靶標分子并用酶(比如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖醛酸苷酶或半乳糖苷酶)來標記靶標分子。然后使用酶以濃度依賴性方式將底物轉化為可檢測的產物，使得可測定靶標分子的濃度(圖1)。該方法通常比直接標記方法更加靈敏，因為一種酶標記可將許多底物分子快速轉化為可檢測的產物分子。
4、在elisa中，捕獲抗體結合于固相，比如微孔板的表面，并使用讀出器(比如熒光板讀出器)測量模擬信號。可在空間上進行多重復用，其中樣品在含有不同的捕獲抗體并向其添加不同的檢測抗體的微孔板的不同孔之間分流。也可進行單鍋多重復用，但每種靶標需要不同的酶和底物對，這增加一般地不實用的額外復雜性。或者，捕獲抗體可連接于微珠或磁性微珠以更易于處理或改進工作流程(圖1)。
5、除elisa之外，還可使用免疫pcr(ipcr)量化蛋白和其他分子。該方法以與elisa類似的方式使用親和試劑，但與elisa不同，檢測試劑(例如抗體)不是用酶而是用核酸(na)標簽進行標記。na標簽可共價連接于抗體(形成綴合物)或通過相互作用比如生物素-鏈霉親和素鍵來連接。標簽通常通過定量pcr(qpcr)進行擴增以測定靶標分子的濃度。與elisa類似，可使用包被有捕獲抗體的微孔板以模擬信號形式進行ipcr。免疫復合物可保持完整，或者可在進行pcr之前分離以釋放na標簽。可使用數字pcr以液滴或微孔陣列形式檢測釋放的標簽，從而獲得更高精確度的量化。可通過在單重反應之間分流樣品，或通過在單個反應中使用具有不同顏色探針組的多個獨特標簽序列來實現多重復用。
6、與elisa類似，也可使用結合于珠粒的捕獲抗體進行ipcr(圖2)。用單獨的捕獲抗體將不同編碼的珠粒組功能化，使得可從光學信號(例如來自連接于或嵌入在珠粒中的不同濃度的多種染料的熒光)解碼結合于每個珠粒的捕獲抗體的身份。可將不同組的珠粒混合在一起以形成珠粒文庫或測定小組，其可量化單個樣品中的多種分析物(圖3)。
7、在典型的基于珠粒的ipcr測定中，將珠粒與樣品一起溫育以捕獲靶標分子，洗滌以去除樣品基質，并然后用檢測抗體進行標記(圖4)。如果檢測抗體共價連接于核酸標簽(即檢測抗體-na綴合物或“檢測綴合物”)，則免疫復合物為完整的。然而，如果檢測抗體為生物素化的，則將珠粒連續地與鏈霉親和素和生物素化的na標簽一起溫育。定量pcr用于測定na標簽的數量，從而測定初始樣品的濃度。多重測定比單重測定更加復雜，因為每種靶標分子均需要不同的捕獲和檢測抗體對。
8、如同上述數字elisa一樣，在數字ipcr測定中，將珠粒加載到單個反應孔中以將pcr反應彼此分開。大多數孔僅含有一個珠粒和少量含有擴增標簽序列的引物的pcr主混合物。pcr擴增在例如用不混溶的油密封孔之后進行。通過檢查光學特性(比如在一個或多個波長下的熒光強度)來確定珠粒的身份。可通過幾種方法來鑒定pcr陽性珠粒，比如測量雙鏈dna(dsdna)-插入染料或水解探針(例如taqman探針)的熒光信號。
9、在低靶標分子濃度下，大多數珠粒將具有零或一個檢測綴合物，并且pcr陽性珠粒的百分比(即數字信號)可與poisson統計一起用于確定每珠粒的平均檢測綴合物數目，從而確定樣品中靶標分子的濃度。在高靶標濃度下，大多數珠粒可能具有多于一個檢測綴合物，并因此可使用模擬信號(例如實時pcr或對靶標分子整體的另一定量測量)確定每個珠粒上的檢測綴合物數目。組合數字和模擬pcr信號提供很大的動態范圍(在某些條件下高達約1010)，同時在低靶標濃度下仍保持數字pcr的精確定量能力。
10、在以上詳述的所有免疫測定中，必須針對每種靶標分子優化檢測親和試劑(例如抗體)的濃度。例如，如果檢測抗體濃度太低，則測定將具有差的靈敏度，因為捕獲的靶標分子將無法有效標記。增加檢測抗體濃度提高靈敏度，因為更多捕獲的靶標分子被標記，但這也可能會增加測定的背景信號。背景信號的增加通常由檢測試劑與微孔或微珠表面的非特異性結合(nsb)、與捕獲抗體的相互作用或基于珠粒的免疫測定中與珠粒編碼染料的相互作用引起。不幸的是，無法區分源自正確形成的免疫復合物(圖5，復合物a)的陽性信號與非特異性相互作用(比如捕獲抗體和檢測抗體(圖5，復合物b)、捕獲抗體和na標簽(圖5，復合物c)或na標簽和珠粒表面(圖5，復合物d)之間的相互作用)。應該注意的是，檢測抗體綴合物的抗體部分也可與珠粒表面相互作用(圖5，復合物e)，并且nsb可在檢測抗體與樣品基質中可能已特異性或非特異性地結合了珠粒或捕獲抗體的其他蛋白之間發生。
11、當單重測定被合并成多重小組(通常需要重新優化檢測抗體濃度和其他測定參數)時，上述nsb相互作用變得更加嚴重。nsb在多重測定中增加的主要原因是隨著向測定中添加更多靶標分子，總的檢測抗體濃度也增加，這一般地會增加由于nsb觀察到的信號。另外，抗體和脫靶分子之間的交叉反應性在多重測定形式中可能成為更大的問題。有多種形式的交叉反應會影響測定信號。例如，抗原可結合錯誤的(脫靶)捕獲抗體，并然后被其自身的檢測抗體檢測到，這將導致假陽性信號。在類似的實例中，抗原可結合錯誤的(脫靶)捕獲本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種試劑盒，其包含：
2.權利要求1的試劑盒，其中所述固體支持物進一步包含接頭(例如特異性結合對的一個構件)并且所述接頭在所述固體支持物的表面上，任選地其中所述固體支持物用多個接頭包被和/或功能化。
3.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中第一分子識別元件和/或第一核酸序列連接(例如共價和/或非共價)于所述接頭(例如所述特異性結合對的一個構件)。
4.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中所述接頭為鏈霉親和素和第一分子識別元件為生物素化的分子識別元件，并且第一分子識別元件經由鏈霉親和素和生物素的結合而連接于所述固體支持物。
5.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中所述接頭為鏈霉親和素和第一核酸序列為生物素化的，并且第一核酸序列經由鏈霉親和素和生物素的結合而連接于所述固體支持物。
6.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中第一核酸序列包含約10、20或25個核苷酸-約30、40、50或60個核苷酸。
7.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中第二核酸序列包含約20、30、40、50或60個核苷酸-約70、80、90、100
8.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中第二核酸序列包含與第一核酸序列中的序列(例如約5個或更多個連續核苷酸)基本上相同的序列(例如約5個或更多個連續核苷酸)，任選地其中與第一核酸序列中的序列基本上相同的所述序列存在于第二核酸序列的5'區域中。
9.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中第一核酸序列和/或第二核酸序列包含單鏈DNA。
10.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中第一核酸序列和/或第二核酸序列包含雙鏈DNA。
...【技術特征摘要】
1.一種試劑盒，其包含：
2.權利要求1的試劑盒，其中所述固體支持物進一步包含接頭(例如特異性結合對的一個構件)并且所述接頭在所述固體支持物的表面上，任選地其中所述固體支持物用多個接頭包被和/或功能化。
3.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中第一分子識別元件和/或第一核酸序列連接(例如共價和/或非共價)于所述接頭(例如所述特異性結合對的一個構件)。
4.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中所述接頭為鏈霉親和素和第一分子識別元件為生物素化的分子識別元件，并且第一分子識別元件經由鏈霉親和素和生物素的結合而連接于所述固體支持物。
5.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中所述接頭為鏈霉親和素和第一核酸序列為生物素化的，并且第一核酸序列經由鏈霉親和素和生物素的結合而連接于所述固體支持物。
6.任何一項前述權利要求的試劑盒，其中第一核酸...
【專利技術屬性】
技術研發人員：W·H·亨利，E·A·德索夫，J·M·拉姆齊，
申請(專利權)人：北卡羅來納查佩爾山大學，
類型：發明
國別省市：
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