【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)，具體涉及一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法。
技術(shù)介紹
1、腸道神經(jīng)突觸是腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric?nervous?system,ens)的重要組成部分，ens常被稱為“第二大腦”。它具有相對獨(dú)立的功能，能夠自主控制腸道的多種生理活動。ens由大量神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，這些細(xì)胞通過突觸連接形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。這些神經(jīng)突觸不僅參與了腸道的運(yùn)動控制，還涉及到了腸道的感覺、分泌和血管調(diào)節(jié)等多種功能。近年來，隨著對ens研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到ens在許多消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，如腸易激綜合征(irritable?bowel?syndrome,ibs)、克羅恩病(crohn'sdisease)以及慢性便秘等。因此，深入研究ens，尤其是腸道神經(jīng)突觸的機(jī)制，對于揭示這些疾病的病理生理學(xué)具有重要意義。
2、為了更好地理解ens的功能和病理機(jī)制，研究者們需要開發(fā)有效的方法來提取和研究小鼠腸道神經(jīng)突觸。傳統(tǒng)的提取方法存在一定的局限性，例如難以保持突觸結(jié)構(gòu)的完整性，或者在提取過程中可能會損傷神經(jīng)細(xì)胞，此外突觸提取方法較為繁瑣。
3、因此，開發(fā)一種新的、能夠保持突觸結(jié)構(gòu)和功能完整性且操作簡便的提取方法顯得尤為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提出了一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，通過梯度離心技術(shù)，有效分離和富集腸道神經(jīng)突觸提高小鼠腸道神經(jīng)突觸，提高提取突觸蛋白的純度并保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
2、
3、一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，包括如下步驟：
4、s1.在低溫條件下取出小鼠小腸組織，縱向剖開腸道管腔后充分清洗小腸，去除腸道內(nèi)容物；
5、s2.將小腸組織轉(zhuǎn)移至含有5mm?edta和1mm?dtt的無ca2+、mg2+的hank’s平衡溶液中，旋轉(zhuǎn)洗滌處理后進(jìn)行渦旋振蕩，然后利用濾網(wǎng)獲取小腸組織，重復(fù)數(shù)次；
6、s3.將小腸組織平均分割為5cm，每5cm小腸組織加入1ml突觸提取保護(hù)液；轉(zhuǎn)移至組織研磨器中，充分研磨后，將樣本轉(zhuǎn)移至1.5mlep管中，放置碎冰中暫存；
7、s4.對樣本進(jìn)行初次離心處理，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mlep管中；然后進(jìn)行二次離心處理，去除上清液，保留沉淀，每管加入1ml的0.4m蔗糖溶液充分混勻；
8、s5.配置1.2m蔗糖溶液、1m蔗糖溶液、0.8m蔗糖溶液并予以4℃保存，在超速離心管中傾斜45°，依次按照1.2m蔗糖溶液(1ml)、1m蔗糖溶液(1ml)、0.85m蔗糖溶液(1ml)的順序，緩慢沿著管壁加入，設(shè)置成梯度蔗糖溶液；最后緩慢加入s4所得沉淀完全混勻的0.4m蔗糖溶液，最終形成1.2m、1m、0.8m、0.4m的蔗糖梯度溶液；
9、s6.進(jìn)行超速離心處理，然后取出超速離心管，仔細(xì)收集1m-1.2m蔗糖溶液之間的突觸蛋白，移至1.5mlep管中得到突觸溶液；
10、s7.將得到的突觸溶液加入同體積的冰冷1％triton-x，冰上孵育15分鐘后，在4℃條件下以30000g離心30分鐘，去除上清液，取沉淀物即為腸道突觸。
11、作為改進(jìn)，s1步驟中所述低溫條件為在4℃的生理鹽水中。
12、作為改進(jìn)，s2步驟中所述旋轉(zhuǎn)洗滌和渦旋振蕩的條件為：在37℃條件下以20轉(zhuǎn)/分鐘的速度旋轉(zhuǎn)洗滌30分鐘，然后渦旋震蕩20秒。
13、作為改進(jìn)，s4步驟中所述初次離心處理的條件為：在4℃條件下以1000g離心5分鐘；所述二次離心處理的條件為：在4℃條件下，以15000g離心20分鐘。
14、作為改進(jìn)，s6步驟中所述超速離心處理的條件為：在4℃條件下，利用超速離心機(jī)以85000g，離心2小時(shí)。
15、本專利技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于：
16、1.本專利技術(shù)是提出了制備小鼠腸道神經(jīng)突觸的方案，利用梯度離心的方法精確提取小鼠腸道神經(jīng)突觸，所提取的突觸蛋白純度高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以有助于了解腸道神經(jīng)突觸的機(jī)制有助于揭示許多消化系統(tǒng)疾病的病理生理學(xué)，對于疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。
17、2.本專利技術(shù)通過梯度離心技術(shù)，可以有效地分離和富集腸道神經(jīng)突觸，避免了其他組織和細(xì)胞的污染，從而提高了突觸蛋白的純度。同時(shí)，該方法在提取過程中盡量減少了對突觸結(jié)構(gòu)的損傷，保持了突觸的完整性。
18、3.本專利技術(shù)提供的方法步驟清晰，操作簡便，易于實(shí)驗(yàn)室人員學(xué)習(xí)和掌握，有利于推廣應(yīng)用。與傳統(tǒng)的提取方法相比，本專利技術(shù)的方法可以更快速地完成突觸的提取，提高實(shí)驗(yàn)效率。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，其特征在于，S1步驟中所述低溫條件為在4℃的生理鹽水中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，其特征在于，S2步驟中所述旋轉(zhuǎn)洗滌和渦旋振蕩的條件為：在37℃條件下以20轉(zhuǎn)/分鐘的速度旋轉(zhuǎn)洗滌30分鐘，然后渦旋震蕩20秒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，其特征在于，S4步驟中所述初次離心處理的條件為：在4℃條件下以1000g離心5分鐘；所述二次離心處理的條件為：在4℃條件下，以15000g離心20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，其特征在于，S6步驟中所述超速離心處理的條件為：在4℃條件下，利用超速離心機(jī)以85000g，離心2小時(shí)。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，其特征在于，s1步驟中所述低溫條件為在4℃的生理鹽水中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提取小鼠腸道神經(jīng)突觸的方法，其特征在于，s2步驟中所述旋轉(zhuǎn)洗滌和渦旋振蕩的條件為：在37℃條件下以20轉(zhuǎn)/分鐘的速度旋轉(zhuǎn)洗滌30分鐘，然后渦旋震蕩20秒。
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王科皓，李全林，周平紅，王淑君，
申請(專利權(quán))人：慈溪市人民醫(yī)院醫(yī)療健康集團(tuán)慈溪市人民醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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