一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法技術(shù)

技術(shù)編號(hào)：44419763 閱讀：1 留言：0更新日期：2025-02-28 18:35

一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，第一步采用脫細(xì)胞技術(shù)獲得水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)；第二步依據(jù)天然骨鹽成份比例配置復(fù)方骨鹽，并將水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)和復(fù)方骨鹽按照天然骨有機(jī)和無(wú)機(jī)成份比例混合成為仿生基質(zhì)成份，隨后將仿生基質(zhì)成份加入明膠構(gòu)建完全仿生的成骨微環(huán)境；第三步進(jìn)行骨再生材料的構(gòu)建，形成骨類器官，先制備具有全仿生成骨微環(huán)境顆粒狀明膠支架→再進(jìn)行接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞→最后體外培養(yǎng)，依靠支架的成骨微環(huán)境調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化、分泌最終形成骨類器官。

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【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物骨再生細(xì)胞領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法。

技術(shù)介紹

1、骨缺損臨床常見(jiàn)，且骨缺損通常很難自然再生，但是很多難治性骨缺損需要人為干預(yù)。組織工程的出現(xiàn)為其提供理想的治療策略，即結(jié)合支架材料，微環(huán)境，種子細(xì)胞協(xié)同修復(fù)骨缺損。而多數(shù)骨缺損比較復(fù)雜，加上臨床微創(chuàng)修復(fù)的理念，因此需要一款具有強(qiáng)力促成骨效果且容易臨床應(yīng)用的修復(fù)策略。

2、國(guó)際公開(kāi)wo2011/108537號(hào)公報(bào)，中所記載的細(xì)胞支撐體由多孔體構(gòu)成，且作為骨再生材料而有用，但就軟骨再生能而言不明確，該多孔體由生降解性材料構(gòu)成，并具有規(guī)定的氣孔率、規(guī)定的平均氣孔尺寸、氣孔間連通孔及規(guī)定的吸水率。日本特表2001-519210號(hào)公報(bào)，中記載有一種多層膜，其包括主要包含膠原蛋白ii型，并具有海綿狀的開(kāi)放型結(jié)構(gòu)的基質(zhì)層及至少一個(gè)具有相對(duì)不浸透性的封閉型結(jié)構(gòu)的阻擋層。專利文獻(xiàn)2中記載有上述多層膜尤其適合用于骨頭組織或軟骨組織在生物體內(nèi)再生。

3、目前沒(méi)有報(bào)道篩選出哪種濃度顆粒明膠適合骨再生，目前沒(méi)有報(bào)道具有完全仿生的無(wú)機(jī)礦化微環(huán)境和有機(jī)成骨微環(huán)境結(jié)合的可注射類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生。

4、本專利技術(shù)聚焦臨床，以可注射修復(fù)為目標(biāo)，構(gòu)建具有強(qiáng)礦化微環(huán)境和有機(jī)仿生微環(huán)境的可注射類器官，實(shí)現(xiàn)骨再生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本專利技術(shù)的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺點(diǎn)，而提供一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法。

2、本專利技術(shù)是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：</p>

3、一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，其特征在于：第一步采用脫細(xì)胞技術(shù)獲得水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)；第二步依據(jù)天然骨鹽成份比例配置復(fù)方骨鹽，并將水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)和復(fù)方骨鹽按照天然骨有機(jī)和無(wú)機(jī)成份比例混合成為仿生基質(zhì)成份，隨后將仿生基質(zhì)成份加入明膠構(gòu)建完全仿生的成骨微環(huán)境；第三步進(jìn)行骨再生材料的構(gòu)建，形成骨類器官，先制備具有全仿生成骨微環(huán)境顆粒狀明膠支架→再進(jìn)行接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞→最后體外培養(yǎng)，依靠支架的成骨微環(huán)境調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化、分泌最終形成骨類器官。

4、進(jìn)一步所述，第一步采用脫細(xì)胞技術(shù)獲得水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)的步驟如下：

5、取豬的脛骨，并獲取脛骨骨膜，隨后依次經(jīng)過(guò)冰晶成形破碎(骨膜放入液氮3-5min，隨后立即放入37°搖床化開(kāi)，如此反復(fù)操作5次，目的：讓細(xì)胞內(nèi)冰晶形成刺破細(xì)胞膜，便于后續(xù)脫細(xì)胞處理)，5％triton-x100溶液破膜處理48h，每12h換一次液，10mm?tris?hcl處理48h，每12h換一次液，隨后使用100u/mldna酶和5u/mlrna酶去除殘留核酸。之后用1mg/ml胃蛋白酶再ph＝2的液體中消化，隨后調(diào)節(jié)ph到7并凍干，完成水溶性脫細(xì)胞基質(zhì)的制備。

6、進(jìn)一步所述，第二步構(gòu)建完全仿生的成骨微環(huán)境的步驟如下：

7、依據(jù)天然骨鹽成份比例配置復(fù)方骨鹽，并將水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)和復(fù)方骨鹽按照天然骨有機(jī)和無(wú)機(jī)成份比例(有機(jī)：無(wú)機(jī)＝3：7)混合成為仿生基質(zhì)成份，隨后將仿生基質(zhì)成份加入明膠構(gòu)建完全仿生的成骨微環(huán)境。

8、作為優(yōu)選，所述復(fù)方骨鹽成份是由84％磷酸鈣，10％碳酸鈣，2％檸檬酸鈣，2％磷酸鎂，2％磷酸氫二鈉混合組成。

9、進(jìn)一步所述，第三步進(jìn)行骨再生材料的構(gòu)建具體步驟如下：

10、(5)將0.4％、0.6％、0.8％、1％明膠融入去離子水，隨后依次放入-4°12h，-10°12h，-20°8h，-80°4h梯度平穩(wěn)降溫成孔構(gòu)建，獲得均勻孔徑支架。

11、目的：讓冰晶均勻生成，這樣就可以獲得均勻孔徑的支架，這樣更有利于組織的均質(zhì)再生。此時(shí)還沒(méi)有成為最終的支架。還需要在凍干機(jī)凍干，凍干后需要進(jìn)行交聯(lián)(否則遇到水就化了)，交聯(lián)后清洗多余交聯(lián)劑再次凍干才能制備成為最終的明膠支架。

12、(6)將均勻孔徑支架進(jìn)行凍干處理；

13、作為優(yōu)選，所述凍干處理是放在在凍干機(jī)24h凍干獲得明膠支架。

14、目的是升華冰晶，制備支架的多孔結(jié)構(gòu)。

15、(7)將交聯(lián)劑0.5％edc和0.3％nhs溶解到95％乙醇中，使用該溶液交聯(lián)凍干的明膠支架12h，隨后用去離子水洗去多余交聯(lián)劑再次凍干；再次凍干的明膠使用剪刀剪成2x2mm的小塊備用。

16、具體地所述，edc:(二甲氨基)丙基)碳二亞胺；nhs?n-羥基琥珀酰亞胺。支架用95％乙醇溶解交聯(lián)劑，交聯(lián)劑室溫侵泡首次凍干的明膠支架12小時(shí)即可完成交聯(lián)。剪成小塊是為了能夠可注射。

17、(8)將上述顆粒狀明膠支架進(jìn)行細(xì)胞懸液(1x107個(gè)/ml)接種支架，孵育2-4h后再加培養(yǎng)基，隨后在含有10％胎牛血清和1％雙抗的低糖dmem中培養(yǎng)7天，之后將其離心處理，裝入注射器用于實(shí)現(xiàn)快速骨再生。

18、本專利技術(shù)的有益效果：本專利技術(shù)由于采用上述技術(shù)方案，聚焦臨床，以可注射修復(fù)為目標(biāo)，構(gòu)建具有強(qiáng)礦化微環(huán)境和有機(jī)仿生微環(huán)境的可注射類器官，實(shí)現(xiàn)骨再生。

19、下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本專利技術(shù)做進(jìn)一步說(shuō)明。

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【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

1.一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，其特征在于：第一步采用脫細(xì)胞技術(shù)獲得水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)；第二步依據(jù)天然骨鹽成份比例配置復(fù)方骨鹽，并將水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)和復(fù)方骨鹽按照天然骨有機(jī)和無(wú)機(jī)成份比例混合成為仿生基質(zhì)成份，隨后將仿生基質(zhì)成份加入明膠構(gòu)建完全仿生的成骨微環(huán)境；第三步進(jìn)行骨再生材料的構(gòu)建，形成骨類器官，先制備具有全仿生成骨微環(huán)境顆粒狀明膠支架→再進(jìn)行接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞→最后體外培養(yǎng)，依靠支架的成骨微環(huán)境調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化、分泌最終形成骨類器官。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，其特征在于：第一步采用脫細(xì)胞技術(shù)獲得水溶性骨膜脫細(xì)胞基質(zhì)的步驟如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，其特征在于：第二步構(gòu)建完全仿生的成骨微環(huán)境的步驟如下：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，其特征在于：有機(jī)：無(wú)機(jī)＝3：7。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，其特征在于：復(fù)方骨鹽成份是由84％磷

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，其特征在于：第三步進(jìn)行骨再生材料的構(gòu)建具體步驟如下：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種構(gòu)建可注射骨類器官實(shí)現(xiàn)快速骨再生的方法，其特征在于：

...

【技術(shù)特征摘要】

3.根...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭潤(rùn)泉，岳憲虎，張寧，毛松波，閆雪松，李家威，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：鄭潤(rùn)泉，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：

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