【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于新農用化合物免疫檢測，特別涉及一種n-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺半抗原、抗原、抗體、膠體金檢測試紙條及應用。
技術介紹
1、水稻紋枯病是水稻的三大病害之一，病菌寄主范圍廣泛、兼有寄生性和腐蝕性，營養帶很寬，抗逆性強，又屬土傳病害，隱蔽性強，外觀發病時治理非常困難。生產上，常用的防治方法主要有農業防治、物理防治、化學防治、生物防治等，其中化學防治是最有效的措施，可在短時間內將其控制。然而，長時間單一使用某一種藥劑，如井岡霉素，也會存在抗藥性的風險，因此，探尋新型替代品種開發潛在的殺菌劑刻不容援。本專利技術前期改造獲得一種新型殺菌化合物n-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺(n-(naphthalen-1-yl)phenazine-1-carboxamide，nnpcn)，其對紋枯病菌具有較強的抑制效果，開發成水稻紋枯病候選藥物的前景廣闊。這類新殺菌化合物對環境的安全性未知，因此，加強檢測非常重要。目前，有關殺菌劑的檢測多利用實驗室色譜儀進行檢測，如：氣相色譜檢測、液相色譜檢測以及氣質聯用儀、液質聯用儀等，但是檢測的費用高、時間長、步驟多，對技術員和環境的要求較高，限制了其推廣和應用，在基層很難普及。采用免疫學檢測方法不僅具有特異性強，靈敏度高，而且成本低、操作簡單、時間快、對儀器的依賴低等優勢，成為近年來研制的熱點。基于此，通過文獻調研至今未發現有關nnpcn免疫檢測的報道，而且其本身不屬于半抗原，直接接種到動物體內，不會產生抗體。考慮到以上幾點，丞需設計和開發一種適合nnpcn半抗原，并由此建立相應的nnpcn快速
技術實現思路
1、本專利技術旨在克服現有技術的問題，提供一種一種n-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺(n-(naphthalen-1-yl)phenazine-1-carboxamide，nnpcn)半抗原、抗原、抗體、膠體金檢測試紙條及應用。為了達到上述目的，本專利技術提供的技術方案為：
2、本專利技術所要解決的技術問題之一是提供了一種新殺菌化合物半抗原。由于nnpcn(結構式為分子式為c23h15n3o，分子量為349)分子結構上無可以直接與載體耦聯的活性基團，需先在其結構上適當位置進行化學修飾，引入合適的連接臂和載體蛋白耦聯的活性基團。
3、本專利技術首先由吩嗪-1-甲酰胺在酸性條件下水解，得到化合物1，然后化合物1與6-硝基萘-1-胺進行縮合酰化反應得到化合物2，該化合物2中的硝基經氧化還原反應最終制得目標產物n-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺半抗原(nnpcn-nh2，合成路線見式ii)。具體合成步驟如下：在10ml二甲基亞砜中加入吩嗪-1-甲酰胺(0.01mol)和30％的鹽酸10ml，不斷攪拌中緩緩滴加2ml亞硝酸鈉的水溶液(6mol/l)，在冰醇浴中攪拌4h，整個反應過程要保持反應溫度低于0℃。反應完向其中加水60ml，低溫攪拌至不再有固體溶解，然后進行抽濾，將得到的固體水洗4次(每次25ml)，得到的淡黃色固體化合物1。將化合物1置于10ml樣品瓶中并加入苯胺(0.001mol)、6-硝基-1-萘胺(0.001mol)、三氟乙酸硼酸酯(0.002mol)和2ml乙腈，在恒溫磁力攪拌機上在80℃攪拌24h。然后加入3ml三氯甲烷和0.5ml水終止反應，得到化合物2粗產物。再向粗產物中依次加入離子交換樹脂amberlysta-26、amberlyst?15和mberlylite?ira743各150mg，室溫攪拌30min并過濾，并向混合物中依次加入固體硫酸鎂和三氯甲烷以去除水分和多余的固體硫酸鎂。最后進行旋轉蒸發生成橙紅色固體化合物2。將化合物2溶于10ml乙醇中，依次加入5mmol?sncl2，5ml濃hcl，加熱攪拌6h，冷卻之后將溶液ph調節為7，所得溶液經萃取，干燥，減壓蒸餾得到紅色固體產物nnpcn-nh2(c23h16n4o,364.41)，于4℃避光保存。
4、
5、本專利技術所要解決的技術問題之二是提供了一種人工抗原。主要使用戊二醛法將nnpcn-nh2與牛血清白蛋白(bovine?serum?albumin，bsa)和卵清蛋白(ovalbumin，ova)偶聯，制成nnpcn免疫抗原(nnpcn-bsa)與包被抗原(nnpcn-ova)；通過sds-page檢測和紫外光譜掃描顯示，免疫抗原與包被抗原條帶發生拖帶并向后移動，免疫抗原紫外吸收峰203nm和包被抗原紫外吸收峰198nm，均與其各自載體蛋白和nnpcn紫外吸收峰不同，表明成功制備了nnpcn免疫抗原與包被抗原。
6、本專利技術所要解決的技術問題之三是提供了一種新殺菌化合物nnpcn抗體。主要對新西蘭雄性白兔進行免疫，獲得了純化前后效價均大于10萬的nnpcn兔血清多克隆抗體；采用硫酸銨沉淀法純化多克隆抗體，經過sds-page檢測，結果顯示純化抗體在25kda與50kda附近出現清晰條帶，證明多克隆抗體得到較好的純化。
7、本專利技術所要解決的技術問題之四是提供了一種快速免疫膠體金檢測試紙條。該膠體金試紙條主要有pvc底板、樣品墊、膠體金墊、t控制線、c控制線、nc膜、吸水墊組成，能在10-15min內快速檢測土壤中殘存的nnpcn。
8、本專利技術所述多克隆抗體還能用于制備其他檢測n-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺的制劑。
9、與現有技術相比，本專利技術具有的優點為：
10、1、本專利技術首次合成了新殺菌化合物nnpcn半抗原，明確了其結構和特征，為進一步制備抗體提供了材料基礎。
11、2、第一次成功創制了新殺菌化合物nnpcn人工抗原，鑒定了有效性，為后續制備nnpcn多克隆抗體奠定了基礎。
12、3、本專利技術研發了新殺菌化合物nnpcn多克隆抗體，經檢測穩定性好、純度高、效價優、特異性強等。
13、4、本專利技術提供了一種用于檢測nnpcn免疫膠體金試紙條，豐富了nnpcn檢測方法，
14、這為快速檢測nnpcn提供了新思路。
15、總之，本專利技術的內容包括：合成nnpcn-nh2半抗原、創制完全抗原、組裝多克隆抗體、膠體金免疫檢測等構成；所述的nnpcn-nh2半抗原，運用羧酸與氨基的縮合酰化等反應在nnpcn上遠離吩嗪基團位置連接活性基團氨基，經核磁共振、液質聯用對nnpcn-nh2進行結構表征，獲得純品nnpcn-nh2半抗原；使用戊二醛法將nnpcn-nh2與牛血清白蛋白(bovineserum?albumin，bsa)和卵清蛋白(ovalbumin，ova)偶聯，制成nnpcn免疫抗原(nnpcn-bsa)與包被抗原(nnpcn-ova)；通過sds-page檢測和紫外光譜掃描顯示，免疫抗原與包被抗原條帶發生拖帶并向后移動，免疫抗原紫外吸收峰203nm和包被抗原紫外吸收峰198nm，均與其各自載體蛋白和nnpcn紫外吸收峰不同，表明成功制備了nnpcn免疫抗原與包被抗原；對新西蘭雄性白兔進本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式I所示的分子結構式，分子式和分子量為：C23H16N4O，364.41，
2.如權利要求1所述半抗原的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下：
3.如權利要求2所述半抗原的合成方法，其特征在于，所述合成方法具體包括如下步驟：
4.一種基于權利要求1或2所述N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺半抗原與載體蛋白偶聯得到的N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺人工抗原。
5.權利要求4所述的人工抗原，包括免疫抗原和包被抗原。
6.一種基于權利要求5所述人工抗原得到的N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺多克隆抗體；所述多克隆抗體特異性識別N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺、N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺半抗原、N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺人工抗原。
7.權利要求6所述N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺多克隆抗體在制備檢測N-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺制劑中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于，所述試紙條為膠體金
...【技術特征摘要】
1.一種n-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式i所示的分子結構式，分子式和分子量為：c23h16n4o，364.41，
2.如權利要求1所述半抗原的合成方法，其特征在于，所述合成方法如下：
3.如權利要求2所述半抗原的合成方法，其特征在于，所述合成方法具體包括如下步驟：
4.一種基于權利要求1或2所述n-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺半抗原與載體蛋白偶聯得到的n-(萘-1-基)吩嗪-1-甲酰胺人工抗原。
5.權利要求4所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張亞，劉雙清，文鼎，王翀，賈文輝，屈寬，
申請(專利權)人：湖南農業大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。