【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及組織工程和蛋白質(zhì)組學(xué)，具體涉及水凝膠及其在構(gòu)建類器官中的應(yīng)用，尤其涉及一種多肽水凝膠、由其構(gòu)建的胰腺類器官及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、對(duì)于糖尿病不穩(wěn)定或嚴(yán)重并發(fā)癥的患者，胰島移植是最有希望逆轉(zhuǎn)糖尿病自然發(fā)展的治療方法。然而，由于供體的相對(duì)短缺，其臨床應(yīng)用受到了很大的阻礙。近年來(lái)，干細(xì)胞來(lái)源的β(sc-β)細(xì)胞移植治療糖尿病取得了顯著進(jìn)展，從患者誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ipscs)中提取的sc-β細(xì)胞是疾病建模和自體糖尿病細(xì)胞替代治療的有效手段，而目前的研究重點(diǎn)和挑戰(zhàn)在于調(diào)節(jié)胰腺特異性亞群細(xì)胞的產(chǎn)生，增強(qiáng)sc-β細(xì)胞的產(chǎn)生，同時(shí)減少多余細(xì)胞，特別是具有致瘤性的未分化細(xì)胞。在已建立的多步驟胰腺發(fā)育分化系統(tǒng)中，生成具有內(nèi)分泌譜系分化軌跡的胰腺祖細(xì)胞(pps)，最終導(dǎo)致功能性β細(xì)胞分化至關(guān)重要。例如，pdx1+和nkx6.1+pps被認(rèn)為是具有單激素譜系的祖細(xì)胞，決定了β-細(xì)胞的產(chǎn)生。
2、然而，傳統(tǒng)的分化模型忽略了體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)微環(huán)境對(duì)細(xì)胞分化的影響，導(dǎo)致非生理性分化反應(yīng)和分化效率降低；另外，目前的傳統(tǒng)研究中，基于培養(yǎng)板進(jìn)行的ipscs培養(yǎng)及分化存在兩個(gè)問題：(1)kpa級(jí)的基質(zhì)硬度被認(rèn)為是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)最理想的狀態(tài)，而培養(yǎng)板提供的硬度通常為gpa級(jí)，不能夠很好的模擬細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的ecm微環(huán)境；(2)ipscs的培養(yǎng)及分化依賴于matrigel基質(zhì)膠，但其批次間不穩(wěn)定以及含有許多未知的生物成分很難使其用于干細(xì)胞大規(guī)模的培養(yǎng)及分化。
3、近年來(lái)，工程化定義水凝膠因其能夠精確復(fù)制ecm微環(huán)境、基質(zhì)力學(xué)
4、雖然胰腺類器官的建立經(jīng)歷了十幾年的發(fā)展，但其仍面臨著各種挑戰(zhàn)，如結(jié)構(gòu)中細(xì)胞類型和比例的差異；此外，胰腺類器官培養(yǎng)在不同批次和個(gè)體之間也存在顯著差異。因此，開發(fā)穩(wěn)定高效的胰腺分化系統(tǒng)對(duì)實(shí)現(xiàn)胰島生物制造具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的至少一個(gè)不足，本專利技術(shù)的目的為在體外模擬并重建胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的關(guān)鍵信號(hào)線索，提高胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的效率，基于ag73與sdc4之間的配體-受體相互作用，構(gòu)建了ag73-gelma/algma水凝膠，以誘導(dǎo)pdx1+/nkx6.1+胰腺內(nèi)分泌類器官的分化，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，ag73-gelma/algma水凝膠提供了足夠的生物力學(xué)支持和精確的生化信號(hào)引導(dǎo)，促進(jìn)hipscs分化為胰腺內(nèi)分泌譜系。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)的第一個(gè)方面是提供一種多肽水凝膠，其為ag73-gelma/algma水凝膠，其將ag73多肽與gelma/algma水凝膠交聯(lián)制備；其中，所述gelma/algma水凝膠中，gelma的質(zhì)量濃度為5％，algma的質(zhì)量濃度2％；所述ag73多肽的氨基酸序列為cgggrkrlqvqlsirtc。
4、進(jìn)一步地，所述多肽水凝膠的制備步驟包括：
5、步驟s1、gelma/algma水凝膠的制備：將gelma和algma溶解在含苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰的pbs中，將混合物加熱到40～45℃，以確保完全溶解，獲得gelma/algma水凝膠混合物；將制備好的gelma/algma水凝膠混合物過濾滅菌，獲得gelma/algma水凝膠溶液；
6、步驟s2、ag73多肽與gelma/algma水凝膠的交聯(lián)：將ag73多肽以0.05～2mg/ml(優(yōu)選1mg/ml)溶解在步驟s1獲得的gelma/algma水凝膠溶液中，振蕩18～30小時(shí)，獲得ag73-gelma/algma水凝膠。
7、進(jìn)一步地，步驟s1中，pbs中含0.25％(w/v)苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸鋰(lap))，將混合物加熱到42℃。
8、進(jìn)一步地，步驟s1中，過濾滅菌采用0.22μm過濾器。
9、進(jìn)一步地，步驟s2中，振蕩時(shí)間為24小時(shí)。
10、進(jìn)一步地，所述ag73-gelma/algma水凝膠的孔徑為120～150μm。在一具體實(shí)施方式中，其孔徑為136.4±9.3μm。
11、本專利技術(shù)的第二個(gè)方面是提供一種由第一個(gè)方面中任一所述的多肽水凝膠構(gòu)建的胰腺類器官，其構(gòu)建方法包括：對(duì)負(fù)載hipscs的ag73-gelma/algma水凝膠體系進(jìn)行3d打印，將打印好的構(gòu)建物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中孵育48～72小時(shí)后再進(jìn)行四階段誘導(dǎo)分化，獲得所述胰腺類器官。
12、進(jìn)一步地。所述3d打印的步驟包括：將負(fù)載1×106～1×107(優(yōu)選為5×106cells/ml)cells/ml?hipscs的ag73-gelma/algma水凝膠體系封裝，并使用生物打印機(jī)(優(yōu)選dlp打印機(jī))進(jìn)行3d打印；其中，在打印之前，設(shè)計(jì)邊長(zhǎng)為5mm、鏈距為0.4μm的結(jié)構(gòu)；在10mw/cm2的uv光強(qiáng)度下打印60s，總共打印了10層，每層厚度均為100μm。可理解的是，上述打印參數(shù)可根據(jù)體積大小進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整。
13、進(jìn)一步地，將打印好的構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中，在完整的mtesrtmplus培養(yǎng)基中孵育48小時(shí)后進(jìn)行四階段分化，第四階段的5天后獲得所述胰腺類器官。
14、進(jìn)一步地，所述分化為四階段分化，具體為：
15、第一階段(de，3天)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1：500ml?mcdb131+0.8g葡萄糖+0.587g碳酸氫鈉+0.5g?bsa+5ml?glutamax+22mg維生素c；誘導(dǎo)培養(yǎng)基(第1天)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+100ng/mlactivin?a+3μm?chir99021；誘導(dǎo)培養(yǎng)基(第2，3天)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+100ng/ml?activin?a；
16、第二階段(pg，3天)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基2：500ml?mcdb131+0.4g葡萄糖+0.587g碳酸氫鈉+5ml?glutamax+22mg維生素c；誘導(dǎo)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基2+50ng/ml?kgf；
17、第三階段(pfg，3天)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基3：500ml?mcdb131+0.22g葡萄糖+0.877g碳酸氫鈉+10g?bsa+2.本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種多肽水凝膠，其特征在于，所述多肽水凝膠為AG73-GelMA/AlgMA水凝膠，其將AG73多肽與GelMA/AlgMA水凝膠進(jìn)行交聯(lián)制備；其中，所述GelMA/AlgMA水凝膠中，GelMA的質(zhì)量濃度為5％，AlgMA的質(zhì)量濃度2％；所述AG73多肽的氨基酸序列為CGGGRKRLQVQLSIRTC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽水凝膠，其特征在于，所述多肽水凝膠的制備步驟包括：
3.一種由如權(quán)利要求1或2所述的多肽水凝膠構(gòu)建的胰腺類器官，其特征在于，所述胰腺類器官的構(gòu)建方法包括：對(duì)負(fù)載hiPSCs的AG73-GelMA/AlgMA水凝膠體系進(jìn)行3D打印，將打印好的構(gòu)建物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中孵育48～72小時(shí)后通過四階段誘導(dǎo)分化，獲得所述胰腺類器官。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺類器官，其特征在于，所述3D打印的步驟包括：將負(fù)載1×106～1×107cells/mL?hiPSCs的AG73-GelMA/AlgMA水凝膠體系封裝，并使用打印機(jī)進(jìn)行3D打印；其中，在打印之前，設(shè)計(jì)邊長(zhǎng)為5mm、鏈距為0.4μm的結(jié)構(gòu)；在10mW/cm2的UV光強(qiáng)度
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺類器官，其特征在于，將打印好的構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中，在完整的mTeSRTMPlus培養(yǎng)基中孵育48小時(shí)后再進(jìn)行四階段分化，第四階段的5天后獲得所述胰腺類器官。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺類器官，其特征在于，所述胰腺類器官包括PDX1+/NKX6.1+胰腺內(nèi)分泌類器官、SOX9+/PDX1+雙能胰腺類器官。
7.一種如權(quán)利要求1～2中任一所述的多肽水凝膠的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用選自以下應(yīng)用中的至少一種：在構(gòu)建胰腺類器官中的應(yīng)用、在制備SC-β細(xì)胞中的應(yīng)用、在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用、在確定ECM組分和機(jī)械應(yīng)力對(duì)胰腺譜系發(fā)育的調(diào)控作用和分子機(jī)制中的應(yīng)用。
8.一種如權(quán)利要求3～6中任一所述的胰腺類器官的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用選自以下應(yīng)用中的至少一種：在制備SC-β細(xì)胞中的應(yīng)用、在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，將收集的胰腺類器官進(jìn)一步培養(yǎng)并分化，形成內(nèi)分泌祖細(xì)胞和SC-β細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述GelMA/AlgMA水凝膠模擬胰腺的生理剛度，為胰腺類器官分化提供最佳的機(jī)械應(yīng)力和空間結(jié)構(gòu)；所述AG73-GelMA/AlgMA水凝膠促進(jìn)PDX1+/NKX6.1+胰腺內(nèi)分泌器官的生成，提高SC-β細(xì)胞的分化效率和功能；AG73-SDC4介導(dǎo)的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過調(diào)控SDC4-ITGAV-AKT信號(hào)軸，，促進(jìn)了SOX9+/PDX1+雙能胰腺類器官的形成。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種多肽水凝膠，其特征在于，所述多肽水凝膠為ag73-gelma/algma水凝膠，其將ag73多肽與gelma/algma水凝膠進(jìn)行交聯(lián)制備；其中，所述gelma/algma水凝膠中，gelma的質(zhì)量濃度為5％，algma的質(zhì)量濃度2％；所述ag73多肽的氨基酸序列為cgggrkrlqvqlsirtc。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽水凝膠，其特征在于，所述多肽水凝膠的制備步驟包括：
3.一種由如權(quán)利要求1或2所述的多肽水凝膠構(gòu)建的胰腺類器官，其特征在于，所述胰腺類器官的構(gòu)建方法包括：對(duì)負(fù)載hipscs的ag73-gelma/algma水凝膠體系進(jìn)行3d打印，將打印好的構(gòu)建物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中孵育48～72小時(shí)后通過四階段誘導(dǎo)分化，獲得所述胰腺類器官。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺類器官，其特征在于，所述3d打印的步驟包括：將負(fù)載1×106～1×107cells/ml?hipscs的ag73-gelma/algma水凝膠體系封裝，并使用打印機(jī)進(jìn)行3d打印；其中，在打印之前，設(shè)計(jì)邊長(zhǎng)為5mm、鏈距為0.4μm的結(jié)構(gòu)；在10mw/cm2的uv光強(qiáng)度下打印60s，總共打印10層，每層厚度均為100μm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的胰腺類器官，其特征在于，將打印好的構(gòu)建物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中，在完整的mtesrtmplus培養(yǎng)基中孵育48小時(shí)后再進(jìn)行四...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：萬(wàn)建，黃龑，徐陽(yáng)，陸玉華，郭青松，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南通大學(xué)附屬醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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