【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)，具體涉及基于damp4-dipgla-h融合蛋白基因序列的重組載體、重組菌構(gòu)建，及damp4-dipgla-h融合蛋白、dipgla-h重組蛋白的生物合成和抗菌活性測試。
技術(shù)介紹
1、抗菌肽（antimicrobial?peptides，amps）具有良好的抑菌活性，是一類有效、綠色、安全的抗生素替代品。pgla為來源于非洲爪蟾皮膚分泌物中的一種抗菌肽，其對細(xì)菌與真菌都有一定的抑菌效果，tomislav?ron?evi?等人通過對其截短、構(gòu)造串聯(lián)重復(fù)序列，設(shè)計出了具有更好的抗菌活性的人工改造肽，如dipgla-h。dipgla-h由20個氨基酸殘基組成，氨基酸序列為kiakvalkalkiakvalkal，其具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)，易溶于水。同時dipgla-h具有較低的細(xì)胞毒性和溶血活性，應(yīng)用潛力巨大。
2、dipgla-h的化學(xué)合成工藝復(fù)雜、費用高昂。利用基因工程技術(shù)在微生物系統(tǒng)中通過異源表達(dá)生物合成抗菌肽是實現(xiàn)抗菌肽應(yīng)用的重要方向。然而dipgla-h對常用的表達(dá)宿主均具有抑菌活性，目前為止還未有相關(guān)研究實現(xiàn)dipgla-h的生物合成。此外，生物合成的抗菌肽存在純化工藝復(fù)雜、產(chǎn)量較低的問題。如傳統(tǒng)的純化工藝會選用gst、his、sumo等親和標(biāo)簽蛋白，而這些標(biāo)簽在使用后往往需要昂貴的層析純化方法來生產(chǎn)抗菌肽，這阻礙了抗菌肽的規(guī)模化生產(chǎn)。為此，cn117164722a中提出了利用damp4標(biāo)簽表達(dá)damp4-fr-fo融合蛋白d2l，但并未采用動物模型進(jìn)行融合蛋白d2l抗菌效果的在體實驗
3、另外，《菌絲霉素mp1106融合蛋白的復(fù)性及純化方法》中表達(dá)的融合蛋白在胞內(nèi)為包涵體，需要復(fù)性后再利用tev蛋白酶對融合蛋白進(jìn)行了切割，且對于所制得的mp1106重組蛋白并沒有進(jìn)行抗菌實驗，僅是從蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的角度對融合蛋白進(jìn)行了功能分析。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種damp4-dipgla-h融合蛋白dd1及其制備方法和應(yīng)用。
2、為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用了以下技術(shù)方案：
3、第一方面，提供了一種damp4-dipgla-h融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列是通過標(biāo)簽連接序列（例如柔性剛性適中的連接序列g(shù)pgs）和作為裂解位點的蛋白酶識別序列（例如tev蛋白酶識別序enlyfqg）將damp4與dipgla-h融合而得。
4、優(yōu)選的，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq.id.no.2（即融合蛋白dd1的氨基酸序列）所示。
5、第二方面，提供了一種重組抗菌肽，該抗菌肽為經(jīng)蛋白酶切割上述damp4-dipgla-h融合蛋白而形成的、且氨基端帶有切割后的蛋白酶識別序列的dipgla-h重組蛋白。例如所述抗菌肽是通過tev蛋白酶對融合蛋白dd1經(jīng)宿主菌表達(dá)后的對應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行切割而得到的目的重組蛋白（氨基酸序列為：gkiakvalkalkiakvalkal；記為g-dipgla-h），即生物合成的g-dipgla-h，其中，切割后的tev蛋白酶識別序列為連接在dipgla-h的氨基端的甘氨酸（g）殘基。
6、第三方面，提供了一種基因序列，該基因序列用于編碼上述damp4-dipgla-h融合蛋白，即damp4-dipgla-h融合蛋白的基因序列。
7、第四方面，提供了一種重組表達(dá)載體，該載體含有上述damp4-dipgla-h融合蛋白的基因序列，所述載體是通過將所述基因序列插入到pet28a（該質(zhì)粒含有可以利用插入的目的基因序列進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的乳糖操作子等元件）等大腸桿菌表達(dá)載體中而構(gòu)建得到的，例如pet28a-dd1。
8、第五方面，提供了一種重組菌，該重組菌為含有上述重組表達(dá)載體的宿主菌。例如所述重組菌是通過將重組表達(dá)載體pet28a-dd1導(dǎo)入大腸桿菌并篩選得到的載體克隆用大腸桿菌基因工程菌或作為融合蛋白dd1的原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的大腸桿菌基因工程菌。
9、第六方面，提供了一種damp4-dipgla-h融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：
10、步驟1?根據(jù)damp4和dipgla-h的氨基酸序列設(shè)計damp4-dipgla-h融合蛋白的氨基酸序列及相應(yīng)的目的基因序列（即damp4-dipgla-h融合蛋白的基因序列），對設(shè)計的目的基因序列進(jìn)行合成；所述融合蛋白的氨基酸序列（例如融合蛋白dd1的氨基酸序列）是通過自氨基端到羧基端依次排列的damp4、連接序列（即上述標(biāo)簽連接序列）、蛋白酶識別序列（即上述作為裂解位點的蛋白酶識別序列）和dipgla-h融合而得；
11、步驟2?構(gòu)建含有damp4-dipgla-h融合蛋白的基因序列的重組表達(dá)載體（具體是將所述目的基因序列與表達(dá)載體骨架連接，得到重組表達(dá)載體）；將該重組表達(dá)載體（例如pet28a-dd1）轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌，得到用于表達(dá)damp4-dipgla-h融合蛋白（例如融合蛋白dd1）的基因工程菌；
12、步驟3?利用所述基因工程菌并于胞內(nèi)進(jìn)行damp4-dipgla-h融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，然后對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到damp4-dipgla-h融合蛋白（例如融合蛋白dd1）。
13、優(yōu)選的，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq.id.no.2（即融合蛋白dd1的氨基酸序列）所示。
14、優(yōu)選的，所述融合蛋白的基因序列如seq.id.no.1所示（即融合蛋白dd1的基因序列），該核苷酸序列是經(jīng)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化設(shè)計而得。
15、優(yōu)選的，所述宿主菌選自大腸桿菌bl21（de3）。
16、優(yōu)選的，所述分離純化具體包括以下步驟：經(jīng)相應(yīng)大腸桿菌基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)后，通過加熱并在高鹽作用（0.6~0.9?m硫酸鈉）下裂解細(xì)胞（60~90℃、20~40min），冷卻后通過離心除雜、鹽析（用hcl或h3po4調(diào)節(jié)ph至2.5~3.5后稀釋、靜置）進(jìn)行純化；將純化后的damp4-dipgla-h融合蛋白（例如融合蛋白dd1）重新分散，備用。
17、第七方面，提供了上述damp4-dipgla-h融合蛋白的基因序列、上述重組表達(dá)載體、上述重組菌在生產(chǎn)（生物合成）抗菌肽中的應(yīng)用。例如具體提供了一種重組抗菌肽的制備方法，包括以下步驟：
18、對以上制得的damp4-dipgla-h融合蛋白利用蛋白酶進(jìn)行切割（對于融合蛋白dd1，采用與其所融合的tev蛋白酶識別序列相適應(yīng)的tev蛋白酶，并按照30~60u/ml、酶解≤50min的條件進(jìn)行裂解）以釋放抗菌肽（對于融合蛋白dd1，具體釋放的是氨基端帶有切割后的tev蛋白酶識別序列的dipgla-h重組蛋白，即上述g-dipgla-h），然后進(jìn)行等電沉淀（ph=6.8，以沉淀“damp4-gpgs-enlyfq”），得到重組抗菌肽。
19、第八方面，提供了上述重組抗菌肽在制備用于治療革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種DAMP4-DiPGLa-H融合蛋白，其特征在于：該融合蛋白中是通過標(biāo)簽連接序列和作為裂解位點的蛋白酶識別序列融合DAMP4與DiPGLa-H。
2.一種DAMP4-DiPGLa-H融合蛋白，其特征在于：該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.一種重組抗菌肽，其特征在于：該抗菌肽為氨基端帶有切割后的蛋白酶識別序列的DiPGLa-H重組蛋白。
4.一種重組抗菌肽，其特征在于：該抗菌肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于：該載體含有用于編碼如權(quán)利要求1或2所述的DAMP4-DiPGLa-H融合蛋白的基因序列。
6.一種重組菌，其特征在于：該重組菌含有如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體。
7.一種DAMP4-DiPGLa-H融合蛋白的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
8.一種重組抗菌肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種重組抗菌肽的制備方法，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO
10.如權(quán)利要求3或4所述的重組抗菌肽在制備用于治療革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌或耐藥菌所引起的感染性疾病的藥物中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種damp4-dipgla-h融合蛋白，其特征在于：該融合蛋白中是通過標(biāo)簽連接序列和作為裂解位點的蛋白酶識別序列融合damp4與dipgla-h。
2.一種damp4-dipgla-h融合蛋白，其特征在于：該融合蛋白的氨基酸序列如seq.id.no.2所示。
3.一種重組抗菌肽，其特征在于：該抗菌肽為氨基端帶有切割后的蛋白酶識別序列的dipgla-h重組蛋白。
4.一種重組抗菌肽，其特征在于：該抗菌肽的氨基酸序列如seq.id.no.3所示。
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于：該載體含有用于編碼如權(quán)利要求1或2所述的damp4-...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：薛虎平，鄭良俊，辛清婷，趙麗麗，
申請(專利權(quán))人：西北農(nóng)林科技大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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