【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及重組犬血清白蛋白的載體構(gòu)建及其在漢遜酵母中的表達(dá)。
技術(shù)介紹
1、犬血清白蛋白(canine?serum?albumin，csa)是由584個(gè)氨基酸組成的單鏈蛋白質(zhì)，分子量約為66kda。臨床上主要用于外科手術(shù)前后，治理失血或創(chuàng)傷性休克，急性腎病、腹水等情況引起的白蛋白丟失，顱內(nèi)高壓、胃腸疾病等，在寵物犬醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用場景廣泛。迄今，治療寵物疾病的白蛋白來源仍依賴于人血清白蛋白和動(dòng)物血液中提取的白蛋白，研究發(fā)現(xiàn)在給藥人血清白蛋白的寵物，30％左右的概率引起嚴(yán)重浮腫、炎癥、凝血障礙、皮膚病變、嘔吐、血壓升高甚至死亡等嚴(yán)重副作用；且動(dòng)物血清的供應(yīng)不足、復(fù)雜的血清來源及病毒經(jīng)血液傳播的風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重限制了動(dòng)物血清白蛋白的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)中國寵物行業(yè)現(xiàn)狀分析可知，我國寵物行業(yè)正進(jìn)入高速發(fā)展期，城鎮(zhèn)寵物(犬、貓)市場規(guī)模從2011年的221億元，增長至2022年的2699億元，具體來看，國內(nèi)寵物犬市場規(guī)模高于寵物貓，寵物犬市場規(guī)模同比增長21.2％。
2、2000年發(fā)表的文章escherichia?coli?expression?and?purification?ofrecombinant?dog?albumin,a?cross-reactive?animal?allergen公開了在大腸桿菌中表達(dá)犬血清白蛋白的方法；長春西諾生物科技有限公司于2013年申請的cn103613668b公開了犬血清白蛋白和干擾素融合蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的方法，用以延長干擾素的半衰期、提高干擾素的生物學(xué)活性，但是未提及異源表達(dá)產(chǎn)
3、比較近幾十年關(guān)于犬血清白蛋白異源表達(dá)研究進(jìn)展和日益增長的犬血清白蛋白市場需求發(fā)現(xiàn)，犬血清白蛋白異源表達(dá)仍處在初級研究階段，未有爆發(fā)式的增長。因此為進(jìn)一步推動(dòng)犬血清白蛋白的異源表達(dá)的需求，尋求高效的微生物異源表達(dá)方式成為更多研究者關(guān)注的方向。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題在于提供一種在漢遜酵母菌株中表達(dá)犬血清白蛋白的方法。為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案。
2、本專利技術(shù)提供一種表達(dá)犬血清白蛋白或包含犬血清白蛋白的融合蛋白的重組漢遜酵母，其特征在于，在多形漢遜酵母菌(hansenula?polymorpha)的基因組中整合有表達(dá)犬血清白蛋白的基因元件；
3、具體地，所述的基因元件依次是：啟動(dòng)子元件、信號肽、犬血清白蛋白基因和終止子元件；
4、優(yōu)選地，所述的啟動(dòng)子為漢遜酵母的內(nèi)源啟動(dòng)子，具體是：甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子pgap、質(zhì)膜atpase基因啟動(dòng)子ppma1、翻譯延伸因子1-α啟動(dòng)子ptef1、醇脫氫酶基因啟動(dòng)子padh1；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：麥芽糖酶基因啟動(dòng)子pmal、甲醇氧化酶基因啟動(dòng)子pmox、甲酸脫氫酶基因啟動(dòng)子pfmd、甲醛脫氫酶基因啟動(dòng)子pfld1、二羥丙酮合酶基因啟動(dòng)子pdas、異檸檬酸裂合酶基因啟動(dòng)子picl1；更優(yōu)選地，所述的啟動(dòng)子為蔗糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pmal、pgap，其核苷酸序列為與seq?id?no：5序列或seq?id?no：3同一性至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％。
5、所述的犬血清白蛋白是seq?id?no.1所示的氨基酸序列或與其具有85％以上同源性的氨基酸序列。
6、在具體實(shí)施方式中，犬血清白蛋白的編碼核苷酸序列按照漢遜酵母的密碼子使用頻率進(jìn)行密碼子優(yōu)化，具體地，優(yōu)化后的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，或其與seq?idno.2所示核苷酸序列具有至少85％，例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性的核苷酸序列。
7、具體地，所述終止子為aox1終止子taox1。
8、優(yōu)選地，采用多拷貝的犬血清白蛋白表達(dá)元件在漢遜酵母中的表達(dá)，優(yōu)選為2-4拷貝，例如3拷貝；不同拷貝采用相同或不同的啟動(dòng)子。
9、在具體實(shí)施方式中，通過整合型載體ppiczαa、pgapzαa、ppic9k將所述犬血清白蛋白表達(dá)元件整合到漢遜酵母的基因組上。
10、本專利技術(shù)提供一種重組犬血清白蛋白在漢遜酵母中的表達(dá)方法，其是培養(yǎng)所述的重組漢遜酵母以產(chǎn)生重組犬血清白蛋白。
11、本專利技術(shù)中優(yōu)選重組漢遜酵母表達(dá)菌株的表達(dá)條件為：培養(yǎng)溫度30℃-40℃，ph5.0-7.0，優(yōu)選35℃、36℃、37℃、38℃；ph5.0、ph5.5、ph6.0、ph6.5、ph7.0。
12、優(yōu)選地，其為誘導(dǎo)表達(dá)，所用的誘導(dǎo)劑是非葡萄糖的糖類，優(yōu)選蔗糖，麥芽糖等，更優(yōu)選地采用的蔗糖濃度為1％-8％，優(yōu)選1％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％；以及甲醇的濃度為0.1％-5％，優(yōu)選1％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％。
13、進(jìn)一步地，還包括離心收集上清液并分離或純化重組犬血清白蛋白的步驟。
14、更具體地，培養(yǎng)方法和條件如下：
15、發(fā)酵起始培養(yǎng)基按5l發(fā)酵體積計(jì)：含有酵母粉100g，蛋白胨50g，甘油200g，基礎(chǔ)鹽(k2so4?91g，mgso4?75g，85％h3po4?140ml，koh?25g)，4l純化水充分溶解，加入10l發(fā)酵罐中，純化水定容至4.5l，121℃，30min滅菌，冷卻至30℃后加入20ml?ptm1微量元素液：cuso4·5h2o?6.0g，ki?0.088g，mnso4·h2o?3.0g，na2moo4·2h2o?0.2g，h3bo30.02g，cocl2·6h2o0.5g，zncl2?20.0g，feso4·7h2o?65.0g，biotin?0.2g，亮氨酸0.04g，濃h2so4?5.0ml，純化水定容至1l，0.22μm濾膜過濾除菌；氨水調(diào)節(jié)ph?5.6，接種發(fā)酵種子液，使發(fā)酵體積為5l；
16、起始攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm、空氣流量0.5nm3/h、罐壓0.5bar，發(fā)酵中控制溶氧值為≧20％起始生長期維持約25h后，菌液a600nm達(dá)到55-65，開始以12-18ml/l/h流速流加補(bǔ)料培養(yǎng)基50％甘油(w/v)和12ml?ptm1，此時(shí)進(jìn)入流加生長期；培養(yǎng)6-8h后，菌液a600nm達(dá)到80-100，停止流加，氨水調(diào)節(jié)ph值至6.0；溶氧開始回升后開始流加蔗糖，進(jìn)入誘導(dǎo)表達(dá)期，蔗糖初始流加速率為10ml/h，每小時(shí)取樣，蔗糖電極測定濃度(隨溶氧變化調(diào)節(jié)蔗糖流加速度)，通過調(diào)節(jié)蔗糖流加速率使?jié)舛瓤刂圃冢?g/l。
17、專利技術(shù)有益效果總本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種表達(dá)犬血清白蛋白或包含犬血清白蛋白的融合蛋白的重組漢遜酵母，其特征在于，在多形漢遜酵母菌(Hansenula?polymorpha)的基因組中整合有表達(dá)犬血清白蛋白的基因元件。
2.如權(quán)利要求1所述的重組漢遜酵母，其特征在于，所述的基因元件依次是：啟動(dòng)子元件、信號肽、犬血清白蛋白基因和終止子元件；
3.如權(quán)利要求1所述的重組漢遜酵母，其特征在于，犬血清白蛋白的編碼核苷酸序列按照漢遜酵母的密碼子使用頻率進(jìn)行密碼子優(yōu)化，具體地，優(yōu)化后的核苷酸序列如SEQ?IDNo.2?所示，或其與SEQ?ID?No.2所示核苷酸序列具有至少85%，例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的重組漢遜酵母，其特征在于，所述終止子為AOX1終止子TAOX1。
5.如權(quán)利要求1所述的重組漢遜酵母，其特征在于，采用多拷貝的犬血清白蛋白表達(dá)元件在漢遜酵母中的表達(dá)，優(yōu)選為2-4拷貝，例如3拷貝；不同拷貝
6.如權(quán)利要求5所述的重組漢遜酵母，其特征在于，通過整合型載體pPICZαA、pGAPzαA、pPIC9K將所述犬血清白蛋白表達(dá)元件整合到漢遜酵母的基因組上。
7.一種重組犬血清白蛋白在漢遜酵母中的表達(dá)方法，其特征在于，培養(yǎng)如權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的重組漢遜酵母以產(chǎn)生重組犬血清白蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)方法，其特征在于，其為誘導(dǎo)表達(dá)，所用的誘導(dǎo)劑是非葡萄糖的糖類，優(yōu)選蔗糖，麥芽糖等，更優(yōu)選地采用的蔗糖濃度為1%-8%，優(yōu)選1%、1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%；以及甲醇的濃度為0.1%-5%，優(yōu)選1%、1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%；
9.如權(quán)利要求7或8所述的表達(dá)方法，其特征在于，還包括離心收集上清液并分離或純化重組犬血清白蛋白的步驟。
10.如權(quán)利要求7或8所述的表達(dá)方法，其特征在于，培養(yǎng)方法和條件如下：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種表達(dá)犬血清白蛋白或包含犬血清白蛋白的融合蛋白的重組漢遜酵母，其特征在于，在多形漢遜酵母菌(hansenula?polymorpha)的基因組中整合有表達(dá)犬血清白蛋白的基因元件。
2.如權(quán)利要求1所述的重組漢遜酵母，其特征在于，所述的基因元件依次是：啟動(dòng)子元件、信號肽、犬血清白蛋白基因和終止子元件；
3.如權(quán)利要求1所述的重組漢遜酵母，其特征在于，犬血清白蛋白的編碼核苷酸序列按照漢遜酵母的密碼子使用頻率進(jìn)行密碼子優(yōu)化，具體地，優(yōu)化后的核苷酸序列如seq?idno.2?所示，或其與seq?id?no.2所示核苷酸序列具有至少85%，例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％序列同一性的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的重組漢遜酵母，其特征在于，所述終止子為aox1終止子taox1。
5.如權(quán)利要求1所述的重組漢遜酵母，其特征在于，采用多拷貝的犬血清白蛋白表達(dá)元件在漢...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：柏文琴，鄭雯，王思佳，衛(wèi)茂生，甄杰，付曉平，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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