【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于林木育種的生物，涉及一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存的方法。
技術介紹
1、長白落葉松(larix?olgensis)，又名黃花松、黃花落葉松、朝鮮落葉松，松科(pinaceae)落葉松屬(larix?spp.)植物，是我國東北地區特別是長白山地區的一種重要針葉樹種，具有重要的生態價值，它能夠保持水土、凈化空氣、減少噪音、提供生物棲息地等，對維護生態平衡有著不可替代的作用。體細胞胚胎發生(簡稱體胚發生)是指未經配子融合，從體細胞直接產生類似合子胚結構的過程。與其他育種方式相比，體胚發生具有繁殖系數高、遺傳穩定性強、育種周期短、生產成本低等優點，且體胚發生過程可控性強、易觀察，在理論和實踐研究中具有重要的應用價值。目前，體胚發生已在長白落葉松快速繁殖、種質資源保存和遺傳改良方面得到應用。然而，在離體培養中，胚性愈傷組織會因長期繼代而對后期的發育造成一系列不利影響，具體表現為細胞活力下降、愈傷組織再生能力喪失、基因表達模式改變、再生植株形態和生理異常等方面，嚴重影響系統的穩定性和組織再生效率。
2、超低溫保存指在液氮條件下(-196℃)對植物器官、組織或細胞進行長期保存，在該溫度下細胞內控制各項生長發育的細胞器及參與其中的各種生物酶的活性均受到極大抑制，植物材料內的新陳代謝活動基本處于停止狀態，細胞不再進行分裂，整個植物材料處于“生機停頓”或“假死”狀態。這項技術通常與離體培養技術相結合，能夠實現花粉、愈傷組織、體細胞胚、合子胚、種子、離體分生組織和休眠芽的長期安全保存，是目前國際上公認的最有效、最理想
3、專利公開號cn111466294b，專利技術名稱《一種華北落葉松胚性組織超低溫保存的方法》，公開了：華北落葉松胚性組織(華北落葉松的細胞系胚性愈傷組織)進行滲透劑濃度逐漸升高的液體梯度預培養處理。梯度預培養處理后的華北落葉松胚性組織進行超低溫冷凍保存，使用時再進行解凍處理。該專利技術方法適于對華北落葉松的優良胚性細胞系的長期超低溫保存，采用該專利技術方法長期保存華北落葉松胚性細胞后，細胞存活率高，胚性組織恢復培養迅速，而且胚性愈傷組織恢復生長率高，達到66％以上。但液體梯度預培養操作繁瑣、易染菌，且液體震蕩培養過程中會出現部分材料受損等問題。
技術實現思路
1、本專利技術為了解決上述技術問題，而提供一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存及恢復的方法。
2、本專利技術的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，它是按照以下步驟進行的：
3、一、材料的選擇：
4、選長白落葉松未成熟種子誘導而成的胚性細胞系，以其繼代3-5d的胚性愈傷組織作為備用材料；
5、二、預培養處理：
6、將步驟一的備用材料采用固體增殖培養基進行預培養，預培養方式：依次以0.2mol/l和0.4mol/l的摩爾濃度進行梯度預培養，每個濃度培養20-48h；
7、其中，以0.2mol/l摩爾濃度預培養過程如下：
8、無菌條件下，將步驟一的備用材料平鋪在第一預培養基上，在25℃±2℃溫度下暗培養，培養時間為20-48h；
9、以0.4mol/l摩爾濃度預培養過程如下：
10、無菌條件下，將第一預培養基上的胚性愈傷組織轉移至第二預培養基上，在25℃±2℃溫度下暗培養20-48h；
11、三、冷凍處理：
12、預培養后，將胚性愈傷組織裝入冷凍管中，加入無菌冷凍保護液；將冷凍管放入程序降溫盒中進行程序降溫后，立即投入液氮生物容器中保存。
13、進一步地，步驟二中所述的固體增殖培養基是由100～200mg/l?nh4no3、900～910mg/l?kno3、130～140mg/l?kh2po4、200～250mg/l?mgso4·7h2o、250～260mg/l?mg(no3)2·6h2o、40～60mg/lmgcl2·6h2o、15～20mg/l?h3bo3、10～15mg/l?znso4·7h2o、5～10mg/l?mnso4·h2o、0.1～0.5mg/lna2moo4·2h2o、4～5mg/l?ki、0.1～0.5mg/l?cuso4·5h2o、0.1～0.5mg/l?cocl2·6h2o、10～15mg/lfeso4·7h2o、15～20mg/l?na2-edta、200～250mg/l?ca(no3)2·4h2o、40～45mg/l?cacl2·2h2o、1～5mg/l甘氨酸、0.1～1mg/l煙酸、0.1～1mg/l維生素b6、0.5～2mg/l維生素b1、20～30g/l蔗糖、5～10g/l瓊脂、0.5～2g/l谷氨酰胺、0.5～2g/l肌醇、0.1～1g/l酸水解酪蛋白、0.1～0.5mg/l?2,4-d、0.01～0.1mg/l6-ba、0.01～0.1mg/l?kt和蒸餾水制成，ph值為6.0。
14、進一步地，步驟二中所述的預培養基是
15、由100～200mg/l?nh4no3、900～910mg/l?kno3、130～140mg/l?kh2po4、200～250mg/lmgso4·7h2o、250～260mg/l?mg(no3)2·6h2o、40～60mg/l?mgcl2·6h2o、15～20mg/lh3bo3、10～15mg/lznso4·7h2o、5～10mg/l?mnso4·h2o、0.1～0.5mg/l?na2moo4·2h2o、4～5mg/l?ki、0.1～0.5mg/lcuso4·5h2o、0.1～0.5mg/l?cocl2·6h2o、10～15mg/l?feso4·7h2o、15～20mg/l?na2-edta、200～250mg/l?ca(no3)2·4h2o、40～45mg/l?cacl2·2h2o、1～5mg/l甘氨酸、0.1～1mg/l煙酸、0.1～1mg/l維生素b6、0.5～2mg/l維生素b1、0.2mol/l或0.4mol/l蔗糖、5～10g/l瓊脂、0.5～2g/l谷氨酰胺、0.5～2g/l肌醇、0.1～1g/l酸水解酪蛋白、0.1～0.5mg/l?2,4-d、0.01～0.1mg/l?6-ba、0.01～0.1mg/l?kt、蒸餾水和0.2mol/l或0.4mol/l蔗糖制成，ph值為6.0。
16、進一步地，步驟三中所述的冷凍保護液是以質量百分含量為2％-5％的二甲基亞砜和5％-10％的聚乙二醇為基本保護劑，添加0.4mol/l蔗糖制成。
17、進一步地，步驟三中所述的胚性愈傷組織與無菌冷凍保護液的體積質量比為1ml：(0.3～0.6)g。
18、進一步地，步驟三中所述的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：
2.根據權利要求1所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟二中所述的固體增殖培養基是由100～200mg/L?NH4NO3、900～910mg/L?KNO3、130～140mg/L?KH2PO4、200～250mg/L?MgSO4·7H2O、250～260mg/L?Mg(NO3)2·6H2O、40～60mg/LMgCl2·6H2O、15～20mg/L?H3BO3、10～15mg/L?ZnSO4·7H2O、5～10mg/L?MnSO4·H2O、0.1～0.5mg/L?Na2MoO4·2H2O、4～5mg/L?KI、0.1～0.5mg/L?CuSO4·5H2O、0.1～0.5mg/L?CoCl2·6H2O、10～15mg/L?FeSO4·7H2O、15～20mg/L?Na2-EDTA、200～250mg/L?Ca(NO3)2·4H2O、40～45mg/LCaCl2·2H2O、1～5mg/L甘氨酸、0.1～1mg/L煙酸、0.1～1mg/L維生素B6、0.5～2mg/L維
3.根據權利要求1所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟二中所述的預培養基是
4.根據權利要求1所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟三中所述的冷凍保護液是以質量百分含量為2％-5％的二甲基亞砜和5％-10％的聚乙二醇為基本保護劑，添加0.4mol/L蔗糖制成。
5.根據權利要求1或4所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟三中所述的胚性愈傷組織與無菌冷凍保護液的體積質量比為1mL：(0.3～0.6)g。
6.根據權利要求1所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟三中所述的程序降溫的速率為1℃/min，程序降溫時間為4h以上。
7.一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存后的恢復方法，其特征在于所述的恢復方法如下：
8.根據權利要求7所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存后的恢復方法，其特征在于所述的液體增殖培養基是由100～200mg/L?NH4NO3、900～910mg/L?KNO3、130～140mg/L?KH2PO4、200～250mg/L?MgSO4·7H2O、250～260mg/L?Mg(NO3)2·6H2O、40～60mg/LMgCl2·6H2O、15～20mg/L?H3BO3、10～15mg/L?ZnSO4·7H2O、5～10mg/L?MnSO4·H2O、0.1～0.5mg/L?Na2MoO4·2H2O、4～5mg/L?KI、0.1～0.5mg/L?CuSO4·5H2O、0.1～0.5mg/L?CoCl2·6H2O、10～15mg/L?FeSO4·7H2O、15～20mg/L?Na2-EDTA、200～250mg/L?Ca(NO3)2·4H2O、40～45mg/LCaCl2·2H2O、1～5mg/L甘氨酸、0.1～1mg/L煙酸、0.1～1mg/L維生素B6、0.5～2mg/L維生素B1、20～30g/L蔗糖、0.5～2g/L谷氨酰胺、0.5～2g/L肌醇、0.1～1g/L酸水解酪蛋白、0.1～0.5mg/L?2,4-D、0.01～0.1mg/L?6-BA、0.01～0.1mg/L?KT和蒸餾水制成，pH值為6.0。
9.根據權利要求7所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存后的恢復方法，其特征在于所述的固體增殖培養基是由100～200mg/L?NH4NO3、900～910mg/L?KNO3、130～140mg/L?KH2PO4、200～250mg/L?MgSO4·7H2O、250～260mg/L?Mg(NO3)2·6H2O、40～60mg/LMgCl2·6H2O、15～20mg/L?H3BO3、10～15mg/L?ZnSO4·7H2O、5～10mg/L?MnSO4·H2O、0.1～0.5mg/L?Na2MoO4·2H2O、4～5mg/L?KI、0.1～0.5mg/L?CuSO4·5H2O、0.1～0.5mg/L?CoCl2·6H2O、10～15mg/L?FeSO4·7H2O、15～20mg/L?Na2-EDTA、200～250mg/L?Ca(NO3)2·4H2O、40～45mg/LCaCl2·2...
【技術特征摘要】
1.一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于它是按照以下步驟進行的：
2.根據權利要求1所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟二中所述的固體增殖培養基是由100～200mg/l?nh4no3、900～910mg/l?kno3、130～140mg/l?kh2po4、200～250mg/l?mgso4·7h2o、250～260mg/l?mg(no3)2·6h2o、40～60mg/lmgcl2·6h2o、15～20mg/l?h3bo3、10～15mg/l?znso4·7h2o、5～10mg/l?mnso4·h2o、0.1～0.5mg/l?na2moo4·2h2o、4～5mg/l?ki、0.1～0.5mg/l?cuso4·5h2o、0.1～0.5mg/l?cocl2·6h2o、10～15mg/l?feso4·7h2o、15～20mg/l?na2-edta、200～250mg/l?ca(no3)2·4h2o、40～45mg/lcacl2·2h2o、1～5mg/l甘氨酸、0.1～1mg/l煙酸、0.1～1mg/l維生素b6、0.5～2mg/l維生素b1、20～30g/l蔗糖、5～10g/l瓊脂、0.5～2g/l谷氨酰胺、0.5～2g/l肌醇、0.1～1g/l酸水解酪蛋白、0.1～0.5mg/l?2,4-d、0.01～0.1mg/l?6-ba、0.01～0.1mg/l?kt和蒸餾水制成，ph值為6.0。
3.根據權利要求1所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟二中所述的預培養基是
4.根據權利要求1所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟三中所述的冷凍保護液是以質量百分含量為2％-5％的二甲基亞砜和5％-10％的聚乙二醇為基本保護劑，添加0.4mol/l蔗糖制成。
5.根據權利要求1或4所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟三中所述的胚性愈傷組織與無菌冷凍保護液的體積質量比為1ml：(0.3～0.6)g。
6.根據權利要求1所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存方法，其特征在于步驟三中所述的程序降溫的速率為1℃/min，程序降溫時間為4h以上。
7.一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存后的恢復方法，其特征在于所述的恢復方法如下：
8.根據權利要求7所述的一種長白落葉松胚性愈傷組織超低溫保存后的恢復方法，其特征在于所述的液體增殖培養基是由100～200mg/l?nh4no3、900～910mg/l?kno3、130～140mg/l?k...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李淑娟，王晨，趙文娜，劉鈺，董昊，寧亞靜，崔誠朋，
申請(專利權)人：東北林業大學，
類型：發明
國別省市：
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