【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及青貯飼料質(zhì)量安全控制，具體涉及一種從苜蓿青貯飼料中快速分離關(guān)鍵目標梭菌菌株的方法。
技術(shù)介紹
1、隨著人民生活水平的提高，肉蛋奶等畜禽產(chǎn)品的需求持續(xù)增加，穩(wěn)定的飼草飼料供應(yīng)是畜牧業(yè)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
2、紫花苜蓿（ medicago?satival.）是高產(chǎn)奶牛日糧中重要且不可或缺的組成部分，隨著規(guī)模化、標準化奶牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，對高品質(zhì)植物性蛋白飼料的需求量越來越大，優(yōu)質(zhì)苜蓿已成為不可替代的保障飼草。青貯是苜蓿等飼草重要的貯藏方式之一，其基本原理是通過乳酸菌的厭氧發(fā)酵，使原料中所含的糖分變?yōu)橐匀樗釣橹鞯挠袡C酸，提高體系酸度抑制腐敗微生物活動，并防止原料中養(yǎng)分繼續(xù)被微生物分解或消耗，從而保存原料的養(yǎng)分。然而，苜蓿由于水分含量高、可溶性碳水化合物含量較低、緩沖能高等原因，單獨青貯時極易發(fā)生由梭菌引起的丁酸發(fā)酵，降低青貯飼料的營養(yǎng)價值、導(dǎo)致病原菌增殖及毒素積累危害人和動物健康。因此，研究苜蓿青貯飼料中梭菌多樣性，闡明導(dǎo)致苜蓿青貯過程中梭菌增殖、誘發(fā)丁酸發(fā)酵降低青貯品質(zhì)的機理，開發(fā)抑制梭菌的新技術(shù)，構(gòu)建安全、優(yōu)質(zhì)的苜蓿青貯飼料調(diào)制體系，對發(fā)展現(xiàn)代飼草產(chǎn)業(yè)具有重要意義。
3、近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展極大地豐富了我們對青貯飼料中梭菌菌群的認識。研究人員利用變性梯度凝膠電泳、隨機擴增多態(tài)性、末端限制性片斷多態(tài)性、16srdna克隆文庫、高通量測序等技術(shù)相繼鑒定到 clostridium?perfringens、
4、目前常用的亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是基于傳統(tǒng)分離純培養(yǎng)技術(shù)對青貯飼料中的梭菌菌株進行分離純化，該技術(shù)方法雖然可以獲得梭菌菌株，但存在因目的性不明確而導(dǎo)致費時費工的嚴重缺陷。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述缺陷，本專利技術(shù)提供了一種從苜蓿青貯飼料中快速分離關(guān)鍵目標梭菌菌株的方法，包括：利用高通量測序技術(shù)對苜蓿青貯飼料樣品中的細菌菌群進行多樣性分析，確定青貯飼料樣品中是否含有關(guān)鍵目標梭菌及其豐度；然后利用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)初步分離疑似梭菌菌株；再次利用高通量測序技術(shù)對疑似梭菌菌株進行混檢，根據(jù)混檢結(jié)果，找到對應(yīng)的疑似梭菌菌株，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進行進一步分離純化，獲得純化的關(guān)鍵目標梭菌菌株。
2、本專利技術(shù)的方法通過利用高通量測序技術(shù)對梭菌分離源（苜蓿青貯飼料）進行細菌菌群多樣性檢測，可以及早摒棄不含目標梭菌的青貯飼料樣品，極大減少無效的分離工作量。通過再次利用高通量測序技術(shù)對疑似梭菌菌株進行混檢，可以快速摒棄陰性樣品（非目標梭菌），再次減少無效的分離工作量。通過兩次基于高通量測序技術(shù)的快檢工作，可以極大地減低基于亨蓋特厭氧滾管技術(shù)的菌株分離工作的盲目性，并節(jié)約測試成本。
3、優(yōu)選地，所述方法還包括：獲得純化的關(guān)鍵目標梭菌菌株之后對其進行分離、純化和鑒定。
4、優(yōu)選地，所述方法還包括：在鑒定之后對菌株進行保藏。
5、優(yōu)選地，所述苜蓿青貯飼料樣品為苜蓿青貯飼料浸提液；優(yōu)選地，所述苜蓿青貯飼料浸提液的制備方法包括：將苜蓿青貯飼料與無菌水混合后用無菌均質(zhì)器處理，經(jīng)過濾后制得。
6、優(yōu)選地，利用高通量測序技術(shù)對苜蓿青貯飼料樣品中的細菌菌群進行多樣性分析的步驟包括：將苜蓿青貯飼料浸提液離心收集菌體沉淀、提取細菌基因組dna，采用單分子實時測序技術(shù)，對細菌菌群進行16s?rdna多樣性分析。
7、優(yōu)選地，初步分離疑似梭菌菌株的步驟包括：將含有關(guān)鍵目標梭菌的苜蓿青貯飼料浸提液于75~85℃水浴處理后，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)初步分離疑似梭菌菌株。
8、優(yōu)選地，所述混檢的步驟包括：將疑似梭菌菌株采用亨蓋特厭氧管技術(shù)培養(yǎng)，然后將多株梭菌菌株的培養(yǎng)液混合為一個待測混檢樣品，提取細菌基因組dna，采用單分子實時測序技術(shù)，對疑似梭菌菌株進行混檢。
9、優(yōu)選地，獲得純化的關(guān)鍵目標梭菌菌株后，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)對其進行培養(yǎng)，取培養(yǎng)液離心收集菌體沉淀，提取基因組dna，根據(jù)16s?rdna序列同源性分析對菌株進行鑒定。
10、優(yōu)選地，所述苜蓿青貯飼料為變質(zhì)苜蓿青貯飼料或未變質(zhì)苜蓿青貯飼料。
11、優(yōu)選地，所述苜蓿青貯飼料中添加有乳酸菌劑或蔗糖；所述乳酸菌劑中包括植物乳桿菌和布氏乳桿菌。
12、進一步，本專利技術(shù)提供了所述的方法在青貯飼料質(zhì)量安全控制中的應(yīng)用。
13、最優(yōu)選地，所述方法包括如下步驟：
14、（1）苜蓿青貯飼料浸提液制備：取10?g經(jīng)充分混勻的苜蓿青貯飼料樣品裝入無菌錐形瓶，于超凈工作臺內(nèi)加入90?ml滅菌去離子水，用無菌均質(zhì)器處理1?min，再通過4層無菌紗布過濾，得到青貯飼料浸提液；
15、（2）苜蓿青貯飼料細菌菌群高通量測序：浸提液在10000?rpm、4℃條件下離心15min，收集菌體沉淀。提取細菌基因組dna，采用單分子實時測序技術(shù)，對細菌菌群進行多樣性分析，確定青貯飼料樣品中是否含有關(guān)鍵目標梭菌及其豐度；
16、（3）初步分離疑似梭菌菌株：含有關(guān)鍵目標梭菌的苜蓿青貯飼料浸提液于80℃水浴處理10?min，滅除營養(yǎng)體并激活芽孢萌發(fā)。預(yù)處理后的浸提液接種于固體梭菌選擇性計數(shù)培養(yǎng)基，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)在37℃條件下培養(yǎng)3-5?d，用接種環(huán)挑取因厭氧亞硫酸鹽還原而形成的黑色或褐色菌落，即初步分離獲得疑似梭菌菌株；
17、（4）疑似梭菌菌株混檢：疑似梭菌菌株分別接種于液體強化梭菌培養(yǎng)基，采用亨蓋特厭氧管技術(shù)在37℃條件下培養(yǎng)12-24?h，多株梭菌菌株的培養(yǎng)液混合為一個待測樣品。提取細菌基因組dna，采用單分子實時測序技術(shù)，對疑似梭菌菌株進行混檢，確定混檢樣品中是否含有關(guān)鍵目標梭菌；
18、（5）關(guān)鍵目標梭菌菌株分離和純化：根據(jù)混檢結(jié)果，找到對應(yīng)的疑似梭菌菌株，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進行進一步分離純化，即獲得純化的梭菌菌株；
19、（6）關(guān)鍵目標梭菌菌株鑒定和保藏：純化的梭菌菌株通過16s?本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種從苜蓿青貯飼料中快速分離關(guān)鍵目標梭菌菌株的方法，其特征在于，包括：利用高通量測序技術(shù)對苜蓿青貯飼料樣品中的細菌菌群進行多樣性分析，確定青貯飼料樣品中是否含有關(guān)鍵目標梭菌及其豐度；然后利用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)初步分離疑似梭菌菌株；再次利用高通量測序技術(shù)對疑似梭菌菌株進行混檢，根據(jù)混檢結(jié)果，找到對應(yīng)的疑似梭菌菌株，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進行進一步分離純化，獲得純化的關(guān)鍵目標梭菌菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：獲得純化的關(guān)鍵目標梭菌菌株之后對其進行分離、純化和鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿青貯飼料樣品為苜蓿青貯飼料浸提液；優(yōu)選地，所述苜蓿青貯飼料浸提液的制備方法包括：將苜蓿青貯飼料與無菌水混合后用無菌均質(zhì)器處理，經(jīng)過濾后制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用高通量測序技術(shù)對苜蓿青貯飼料樣品中的細菌菌群進行多樣性分析的步驟包括：將苜蓿青貯飼料浸提液離心收集菌體沉淀、提取細菌基因組DNA，采用單分子實時測序技術(shù)，對細菌菌群進行16S?rDNA多樣性分析。
5.根據(jù)權(quán)利
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述混檢的步驟包括：將疑似梭菌菌株采用亨蓋特厭氧管技術(shù)培養(yǎng)，然后將多株梭菌菌株的培養(yǎng)液混合為一個待測混檢樣品，提取細菌基因組DNA，采用單分子實時測序技術(shù)，對疑似梭菌菌株進行混檢。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，獲得純化的關(guān)鍵目標梭菌菌株后，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)對其進行培養(yǎng)，取培養(yǎng)液離心收集菌體沉淀，提取基因組DNA，根據(jù)16SrDNA序列同源性分析對菌株進行鑒定。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿青貯飼料為變質(zhì)苜蓿青貯飼料或未變質(zhì)苜蓿青貯飼料。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿青貯飼料中添加有乳酸菌劑或蔗糖；所述乳酸菌劑中包括植物乳桿菌和布氏乳桿菌。
10.權(quán)利要求1~9中任一項所述的方法在青貯飼料質(zhì)量安全控制中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種從苜蓿青貯飼料中快速分離關(guān)鍵目標梭菌菌株的方法，其特征在于，包括：利用高通量測序技術(shù)對苜蓿青貯飼料樣品中的細菌菌群進行多樣性分析，確定青貯飼料樣品中是否含有關(guān)鍵目標梭菌及其豐度；然后利用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)初步分離疑似梭菌菌株；再次利用高通量測序技術(shù)對疑似梭菌菌株進行混檢，根據(jù)混檢結(jié)果，找到對應(yīng)的疑似梭菌菌株，采用亨蓋特厭氧滾管技術(shù)進行進一步分離純化，獲得純化的關(guān)鍵目標梭菌菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括：獲得純化的關(guān)鍵目標梭菌菌株之后對其進行分離、純化和鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述苜蓿青貯飼料樣品為苜蓿青貯飼料浸提液；優(yōu)選地，所述苜蓿青貯飼料浸提液的制備方法包括：將苜蓿青貯飼料與無菌水混合后用無菌均質(zhì)器處理，經(jīng)過濾后制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用高通量測序技術(shù)對苜蓿青貯飼料樣品中的細菌菌群進行多樣性分析的步驟包括：將苜蓿青貯飼料浸提液離心收集菌體沉淀、提取細菌基因組dna，采用單分子實時測序技術(shù)，對細菌菌群進行16s?rdna多樣性分析。
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄭明利，孟林，李欽，毛培春，田小霞，
申請(專利權(quán))人：北京市農(nóng)林科學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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