【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及腦膜炎病原體的聯(lián)檢，更具體地，涉及草綠色鏈球菌、b族鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、按蚊伊麗莎白菌和李斯特菌的檢測(cè)。
技術(shù)介紹
1、腦膜炎是一類腦膜彌漫性炎癥性改變的疾病。腦膜就是覆蓋腦的內(nèi)襯，身體其他部位感染后發(fā)生，感染微生物可經(jīng)血液移動(dòng)到覆蓋腦部，即可發(fā)生腦膜炎。草綠色鏈球菌、b族鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、按蚊伊麗莎白菌和李斯特菌是導(dǎo)致腦膜炎的病原體。
2、草綠色鏈球菌(svg)是一群異質(zhì)性病原體的群體，是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，通常呈現(xiàn)為球狀或鏈狀排列，廣泛存在于人體的口腔、呼吸道和消化道等黏膜表面，特別是口腔中的牙齦、舌背和頰黏膜等部位，能夠幫助我們消化食物、抵御外來(lái)病原體的入侵，與其他微生物共同維護(hù)著口腔微生態(tài)平衡，同時(shí)，它也可以引起齲齒、鼓膜炎等口腔疾病，在免疫力低下的情況下，還可能引起心內(nèi)膜炎、腦膜炎等嚴(yán)重感染。草綠色鏈球菌也可以從鼻竇炎、腦膿腫、肝膿腫、肺膿腫等分泌物標(biāo)本中被分離出來(lái)，往往是混合菌群的一部分，常伴有厭氧菌混合感染。
3、b族鏈球菌(group?b?streptococcus，gbs)，又稱無(wú)乳鏈球菌，是一種可定植在健康人體中的革蘭陽(yáng)性球菌。其為條件致病菌，健康成年人的胃腸道和(或)泌尿生殖道帶菌率約為30％，孕婦陰道的帶菌率為25％～40％。10％的新生兒可通過(guò)產(chǎn)道垂直傳播獲得gbs，其中約50％～70％被定植，1％～2％發(fā)展為侵襲性gbs感染，導(dǎo)致敗血癥和(或)細(xì)菌性腦膜炎。gbs為國(guó)外兒童細(xì)菌性腦膜炎常見(jiàn)病原菌之一，神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥發(fā)生率高，預(yù)
4、腦膜炎奈瑟菌(nm)簡(jiǎn)稱為腦膜炎球菌(meningococcus)，又名腦膜炎雙球菌或腦脊髓膜炎雙球菌，是一種革蘭氏陰性菌，是流行性腦脊髓膜炎(簡(jiǎn)稱流腦)的病原菌。腦膜炎奈瑟菌，因其所導(dǎo)致的腦膜炎而聞名，亦會(huì)造成腦膜炎球菌血癥(一種致命性的敗血癥)，只感染人類，并無(wú)寄生的動(dòng)物，是唯一令細(xì)菌性感染腦膜炎成為流行病的病菌。約10％成人的鼻咽中有其蹤跡。
5、按蚊伊麗莎白菌(elizabethkingia?anophelis)是一種需氧、無(wú)動(dòng)力、氧化酶陽(yáng)性、吲哚陽(yáng)性、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，其廣泛分布在各種自然環(huán)境中，包括水、土壤、沉積物、植物和動(dòng)物的消化道內(nèi)。按蚊伊麗莎白菌是一種相對(duì)新發(fā)現(xiàn)的病原體，新生兒、術(shù)后患者或患有基礎(chǔ)疾病的老年人是其易感群體。常規(guī)鑒定方法或生化檢測(cè)方法往往無(wú)法將它們與其他細(xì)菌區(qū)分開(kāi)來(lái)，臨床常錯(cuò)誤地將按蚊伊麗莎白菌鑒定為腦膜敗血伊麗莎白菌。
6、李斯特菌(listeria?monocytogenes，lm)是一類兼性細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，也是一種嗜冷菌，屬于人畜共患病類致病菌，病死率較高。lm致成人感染主要引起腦膜炎和敗血癥。lm致新生兒患病有早發(fā)型和晚發(fā)型，早發(fā)型為宮內(nèi)感染，常導(dǎo)致胎兒敗血癥，晚發(fā)型在出生后2-3天引起腦膜炎、腦膜腦炎和敗血癥。
7、在致病菌種鑒定方面，目前真菌分類、分子分型和鑒定上都有多基因序列分析的應(yīng)用，β-tubulin蛋白基因序列結(jié)合its(internaltranscribedspacer)間區(qū)序列分析可協(xié)助鑒定菌種屬。qpcr(real-timequantitativepcr)實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)通過(guò)分析核糖體dna的its2間區(qū)可迅速準(zhǔn)確檢測(cè)福爾馬林固定石蠟包埋組織中的病原真菌，并鑒定至種屬水平。細(xì)菌培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致難以早期診斷。
8、因此，本領(lǐng)域需求一種產(chǎn)品能夠簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)上述病原體，以便針對(duì)性的提供治療策略，并且靈敏度高，特異性好。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)，第一方面，提供一種快速檢測(cè)腦膜炎病原體的組合物，包括檢測(cè)草綠色鏈球菌、b族鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、按蚊伊麗莎白菌和李斯特菌中至少3種病原體的引物對(duì)和探針：
2、如seq?id?no:1～3所示的檢測(cè)草綠色鏈球菌的引物對(duì)和探針；
3、如seq?id?no:4～6所示的檢測(cè)b族鏈球菌的引物對(duì)和探針；
4、如seq?id?no:7～9所示的檢測(cè)腦膜炎奈瑟菌的引物對(duì)和探針；
5、如seq?id?no:10～12所示的檢測(cè)按蚊伊麗莎白菌的引物對(duì)和探針；以及
6、如seq?id?no:13～15所示的檢測(cè)李斯特菌的引物對(duì)和探針。
7、本專利技術(shù)使用實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)，以特異針對(duì)草綠色鏈球菌、b族鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、按蚊伊麗莎白菌和李斯特菌的taqman熒光探針為基礎(chǔ)，每擴(kuò)增一條dna鏈，產(chǎn)生一個(gè)熒光分子，使得熒光信號(hào)的累積與pcr產(chǎn)物形成完全同步，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)草綠色鏈球菌、b族鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、按蚊伊麗莎白菌和李斯特菌特異識(shí)別。這不僅可以提高草綠色鏈球菌、b族鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、按蚊伊麗莎白菌和李斯特菌早期診斷率，還對(duì)精準(zhǔn)用藥提供了一定的指導(dǎo)。
8、熒光定量pcr(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，在該反應(yīng)體系中，包含一對(duì)特異性引物以及一個(gè)taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；如反應(yīng)體系存在靶序列，pcr反應(yīng)時(shí)探針與模板結(jié)合，dna聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。熒光定量pcr儀能夠監(jiān)測(cè)出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(ct值)與病原體核酸濃度有關(guān)，病原體核酸濃度越高，ct值越小。最終可根據(jù)ct值來(lái)判斷是否感染。
9、進(jìn)一步地，所述組合物還包括如seq?id?no:16～18所示的管家基因rnasep的引物對(duì)和探針。
10、在一些實(shí)施方案中，本專利技術(shù)的組合物可以同時(shí)包括上述引物對(duì)和探針組成的一組或多組。在本文中，“組”是指檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的上游引物、下游引物和探針。
11、進(jìn)一步地，本專利技術(shù)的組合物可以任意組合成檢測(cè)相應(yīng)靶點(diǎn)的任意組合形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行組合，檢測(cè)哪幾個(gè)靶點(diǎn)，即把對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的引物和探針組進(jìn)行組合即可。這些組合形式均包括在本專利技術(shù)中。
12、在一些具體的實(shí)施方案中，本專利技術(shù)組合物用于熒光pcr。
13、在一些具體的實(shí)施方案中，本專利技術(shù)組合物中的探針在5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)。
14、進(jìn)一步地，如seq?id?no:3所示的檢測(cè)草綠色鏈球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為fam；如seq?id?no:6所示的檢測(cè)b族鏈球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為hex或vic；如seq?idno:9所示的檢測(cè)腦膜炎奈瑟菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為rox。
15、進(jìn)一步地，如seq?id?no:12所示的檢測(cè)按蚊伊麗莎白菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為cy5；如seq?id?no:15所示的檢測(cè)李斯特菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為quasar?705；如seq?idno:18所示的檢測(cè)管家基因rnasep的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為atto?425。
16、在一些具體的實(shí)施方案中，探針的3’末端還具有熒光淬滅基團(tuán)，本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種快速檢測(cè)腦膜炎病原體的組合物，其特征在于，包括檢測(cè)草綠色鏈球菌、B族鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、按蚊伊麗莎白菌和李斯特菌中至少3種病原體的引物對(duì)和探針：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，如SEQ?ID?NO:3所示的檢測(cè)草綠色鏈球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM；如SEQ?ID?NO:6所示的檢測(cè)B族鏈球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX或VIC；如SEQ?ID?NO:9所示的檢測(cè)腦膜炎奈瑟菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為ROX。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，如SEQ?ID?NO:12所示的檢測(cè)按蚊伊麗莎白菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為CY5；如SEQ?ID?NO:15所示的檢測(cè)李斯特菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為QUASAR?705。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包括如SEQID?NO:16～18所示的管家基因RnaseP的引物對(duì)和探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，如SEQ?ID?NO:18所示的檢測(cè)管家基因RnaseP的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為ATTO?425。<...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種快速檢測(cè)腦膜炎病原體的組合物，其特征在于，包括檢測(cè)草綠色鏈球菌、b族鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、按蚊伊麗莎白菌和李斯特菌中至少3種病原體的引物對(duì)和探針：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，如seq?id?no:3所示的檢測(cè)草綠色鏈球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為fam；如seq?id?no:6所示的檢測(cè)b族鏈球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為hex或vic；如seq?id?no:9所示的檢測(cè)腦膜炎奈瑟菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為rox。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，如seq?id?no:12所示的檢測(cè)按蚊伊麗莎白菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為cy5；如seq?id?no:15所示的檢測(cè)李斯特菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為quasar?705。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包括如seqid?no:16～18所示的管家基因rnasep的引物對(duì)和探針。...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉曉東，肖紫璇，程星，譚德勇，吳康，戴立忠，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：圣湘生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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