【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及細(xì)胞治療，具體涉及人視網(wǎng)膜類器官在制備用于治療外傷性視神經(jīng)病變中的用途。
技術(shù)介紹
1、外傷性視神經(jīng)病變(traumatic?optic?neuropathy,ton)是一種因頭部或眼部外傷導(dǎo)致視神經(jīng)損傷的嚴(yán)重疾病。據(jù)估計，ton的年發(fā)生率約為每10萬人中有5至15例，且在交通事故、墜落和體育活動中尤為常見。ton的主要癥狀包括視力喪失、視野缺損、對比敏感度降低以及光反射消失。臨床體征包括瞳孔對光反射的減弱或消失、視盤蒼白和視神經(jīng)萎縮。ton導(dǎo)致患者眼腦神經(jīng)連接中斷，視功能不可逆性損傷，目前沒有有效的治療方法。
2、視神經(jīng)是由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)純白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其再生能力極為有限。目前ton的臨床治療手段主要包括糖皮質(zhì)激素治療、手術(shù)減壓、神經(jīng)營養(yǎng)因子以及高壓氧治療等。然而，這些臨床治療手段并不能有效促進(jìn)視神經(jīng)再生和恢復(fù)視覺功能。在研究領(lǐng)域，常規(guī)細(xì)胞治療、基因治療和激活內(nèi)源性干細(xì)胞等新興干預(yù)手段不僅無法克服存活率低、成瘤風(fēng)險、需要預(yù)激活和內(nèi)源性干細(xì)胞耗竭等障礙，還始終無法實現(xiàn)穩(wěn)定有效的眼腦神經(jīng)連接功能性重建。
3、細(xì)胞治療是具有巨大臨床轉(zhuǎn)化潛力的治療策略。自上世紀(jì)80年代以來，科學(xué)家研究了各類修復(fù)視神經(jīng)損傷的種子細(xì)胞，包括臍血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、胎兒視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及人多能干細(xì)胞來源視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等，但受限于損傷環(huán)境中再生適宜要素的缺乏，供體視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長的數(shù)量、距離和導(dǎo)向還十分有限。當(dāng)嵌入到生長因子修飾的3d打印纖維蛋白基質(zhì)后，供體神經(jīng)元在宿主組織中
4、人視網(wǎng)膜類器官(human?retinal?organoids,人視網(wǎng)膜類器官)是人多能干細(xì)胞來源的微小胚胎視網(wǎng)膜組織，包含大量處于人胚胎時期的視網(wǎng)膜干細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其適宜的發(fā)育微環(huán)境。借助在體血管系統(tǒng)和免疫細(xì)胞，人視網(wǎng)膜類器官可以進(jìn)一步完善其發(fā)育微環(huán)境，促進(jìn)其神經(jīng)元分化和成熟，成為更接近人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)在體發(fā)育的組織模型，因此人視網(wǎng)膜類器官具有巨大的臨床應(yīng)用和轉(zhuǎn)化潛能。既往動物試驗證明，當(dāng)人視網(wǎng)膜類器官移植到模式動物變性視網(wǎng)膜或損傷視皮層后均可以與宿主完成結(jié)構(gòu)和功能的整合，改善宿主視覺功能。同時，近期一項臨床試驗研究證明人視網(wǎng)膜類器官移植到視網(wǎng)膜色素變性患者視網(wǎng)膜后其存活時間超過2年且無免疫排斥與腫瘤形成，證明了其臨床應(yīng)用的安全性。人視網(wǎng)膜類器官移植在視神經(jīng)損傷疾病的治療中也極具應(yīng)用前景。既往研究將人視網(wǎng)膜類器官移植到青光眼獼猴的玻璃體腔(視網(wǎng)膜前)，可觀察到人視網(wǎng)膜類器官中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的軸突沿視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維束向視乳頭產(chǎn)生長距離投射，說明人視網(wǎng)膜類器官中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以借助宿主微環(huán)境信號，引導(dǎo)其軸突向腦內(nèi)靶區(qū)定向生長。因此，人視網(wǎng)膜類器官移植是一種具有巨大臨床轉(zhuǎn)化前景的治療手段，理論上可用于修復(fù)因外傷導(dǎo)致的視神經(jīng)損傷，功能性重建中斷的眼腦神經(jīng)連接，但迄今為止并無相關(guān)研究報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)涉及一種基于人視網(wǎng)膜類器官(hros)的新型治療方法，用于修復(fù)因外傷導(dǎo)致的視神經(jīng)病變。本專利技術(shù)通過將誘導(dǎo)分化的人視網(wǎng)膜類器官應(yīng)用到視神經(jīng)損傷區(qū)域，重建功能性眼腦神經(jīng)連接，從而恢復(fù)受損的視功能。
2、本專利技術(shù)公開了人視網(wǎng)膜類器官在制備用于治療外傷性視神經(jīng)病變中的用途，其中，所述人視網(wǎng)膜類器官含有具有典型上皮結(jié)構(gòu)的神經(jīng)視網(wǎng)膜，在根據(jù)本專利技術(shù)的一個實施方案中，神經(jīng)視網(wǎng)膜富含chx10+的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和atoh7+brn3b+視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
3、在根據(jù)本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述人視網(wǎng)膜類器官是通過下述方法制備得到的：
4、1)將人多能干細(xì)胞在5％co2、37℃條件下孵育于第一分化培養(yǎng)基中；優(yōu)選地，所述人多能干細(xì)胞為wae009-a細(xì)胞系；
5、2)在第一分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)6天時，向孵育中的第一培養(yǎng)基中加入重組人bmp4形成第二分化培養(yǎng)基，所述第二分化培養(yǎng)基中重組人bmp4在的終濃度為1.5nm；
6、3)在誘導(dǎo)分化至第18天時，將誘導(dǎo)分化中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至長期培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至第30-40天。
7、所述第一分化培養(yǎng)基包含45％v/viscove改良的dulbecco培養(yǎng)基(imdm，gibco)、45％v/v?hams?f12(gibco)、glutamax(gibco)、1％化學(xué)定義的脂質(zhì)濃縮物(gibco)、10％knockout血清替代物(ksr，gibco)、450μm單硫甘油(sigma-aldrich)、100u/ml青霉素(gibco)、20mm?y-27632(sigma-aldrich)和100μg/ml鏈霉素(gibco)；
8、所述第二分化培養(yǎng)基在第一分化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加入重組人bmp4，所述入重組人bmp4的終濃度為1.5nm；
9、所述長期培養(yǎng)基包含dmem/f12-glutamax培養(yǎng)基、1％v/v?n2補(bǔ)充物(gibco)、10％v/v胎牛血清(fbs，gibco)、0.5μm視黃酸(sigma-aldrich)、0.1mm牛磺酸(sigma-aldrich)、0.25μg/ml?fungizone(gibco)、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。
10、在根據(jù)本專利技術(shù)的一個實施方案中，在培養(yǎng)過程中每3天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液操作。
11、在根據(jù)本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述人視網(wǎng)膜類器官使用前剪成0.5mm*0.5mm*0.5mm的組織塊，或根據(jù)應(yīng)用對象剪成的組織塊。
12、在根據(jù)本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述人視網(wǎng)膜類器官應(yīng)用于視神經(jīng)鞘內(nèi)部或者視神經(jīng)鞘外部。
13、在根據(jù)本專利技術(shù)的一個實施方案中，還包括聯(lián)合施用免疫抑制劑。
14、在根據(jù)本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述免疫抑制劑為環(huán)孢素。
15、在根據(jù)本專利技術(shù)的一個實施方案中，所述外傷性視神經(jīng)病變包括視神經(jīng)完全離斷、部分離斷或鈍挫傷導(dǎo)致的病變
16、本專利技術(shù)的上述技術(shù)方案的有益效果如下：
17、本專利技術(shù)提供的人視網(wǎng)膜類器官培養(yǎng)基組合能夠有效的誘導(dǎo)分化獲得人視網(wǎng)膜類器官，所得到的人視網(wǎng)膜類器官能夠重建中斷的眼腦神經(jīng)連接，恢復(fù)損傷視神經(jīng)的視覺功能和視覺相關(guān)行為，針對不同外傷性視神經(jīng)病變損傷類型和損傷程度，通過將人視網(wǎng)膜類器官應(yīng)用到視神經(jīng)鞘內(nèi)部或者視神經(jīng)鞘外部，均可以產(chǎn)生治療效果。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.人視網(wǎng)膜類器官在制備用于治療外傷性視神經(jīng)病變中的用途，其中，所述人視網(wǎng)膜類器官含有具有典型上皮結(jié)構(gòu)的神經(jīng)視網(wǎng)膜，優(yōu)選地，所述神經(jīng)視網(wǎng)膜富含Chx10+的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和ATOH7+Brn3b+視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述人視網(wǎng)膜類器官是通過下述方法制備得到的：
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其中，在培養(yǎng)過程中每3天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液操作。
4.如權(quán)利要求2或3所述的用途，其中，所述人視網(wǎng)膜類器官使用前剪成0.5mm*0.5mm*0.5mm的組織塊，或根據(jù)應(yīng)用對象剪成的組織塊。
5.如權(quán)利要求2-4中任一項所述的用途，其中，所述人視網(wǎng)膜類器官應(yīng)用于視神經(jīng)鞘內(nèi)部或者視神經(jīng)鞘外部。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中，還包括聯(lián)合施用免疫抑制劑。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其中，所述免疫抑制劑為環(huán)孢素。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的用途，其中，所述外傷性視神經(jīng)病變包括視神經(jīng)完全離斷、部分離斷和鈍挫傷的病變。
【技術(shù)特征摘要】
1.人視網(wǎng)膜類器官在制備用于治療外傷性視神經(jīng)病變中的用途，其中，所述人視網(wǎng)膜類器官含有具有典型上皮結(jié)構(gòu)的神經(jīng)視網(wǎng)膜，優(yōu)選地，所述神經(jīng)視網(wǎng)膜富含chx10+的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和atoh7+brn3b+視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述人視網(wǎng)膜類器官是通過下述方法制備得到的：
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其中，在培養(yǎng)過程中每3天進(jìn)行培養(yǎng)基半換液操作。
4.如權(quán)利要求2或3所述的用途，其中，所述人視網(wǎng)膜類器官使...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：龔宇，李嘉文，
申請(專利權(quán))人：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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