【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學領域。具體而言，本專利技術涉及一種改造的klenow片段及應用。背景介紹klenow酶，也叫klenow片段或者klenow大片段，是大腸桿菌dna聚合酶i經過枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶處理后得到的兩個片段中的分子量較大的那個片段。klenow片段保留了dna聚合酶i的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性、缺少5ˊ-3ˊ外切酶活性，常用于補平dna單鏈末端。另外，試驗也常使用的exo-klenow片段，是klenow片段的突變體，為不具有外切酶活性的klenow片段，該酶也常表示為klenow片段(3'→5'exo-)。klenow片段或exo-klenow片段可在37攝氏度進行聚合反應/擴增，因而利用klenow片段或exo-klenow片段進行擴增反應對實驗設備等的溫控要求相對較低；并且，klenow片段或者exo-klenow片段相對于dna聚合酶i來說，分子量較小，合成相應的核酸序列來構建表達載體相對較容易，便于制備，利于工業應用。klenow片段或exo-klenow片段的擴增效果與該聚合酶本身的特性包括合成能力、保真度/校正能力、特異性/酶活性以及穩定性有關，也與反應環境包括反應條件有關，如測序緩沖液、核苷酸種類、固體介質表面結構(與酶的吸附作用)等。可能由于klenow片段不耐高溫、聚合能力偏低或者說該酶整體表現出的性能相對弱，目前市場上的擴增平臺包括測序平臺等較少使用該酶，也較少對該酶進行改造。提升或者調整klenow片段的某一方面性能，利于增加其工業實用性。
技術介紹
技
1、專利技術人利用野生型klenow片段和市售的klenow片段試劑盒進行測試發現：野生型klenow片段或其常見突變體exo-klenow片段，在核酸序列擴增中尤其在測序反應中，不能獲得較好的結果，如利用該些酶進行核苷酸延伸反應例如測序，獲得的測序平均讀長和有效數據量等測序指標均較不理想；而且，相較于市售的klenow片段，野生型klenow片段和exo-klenow片段在測序中表現出的性能相對更弱。
2、本專利技術旨在至少在一定程度上解決上述技術問題至少之一。
3、為此，本專利技術的第一方面提供了一種改造的klenow片段，該改造的klenow片段氨基酸序列上的f762、a842、i709和p603中的至少一個位置或者功能等效的位置包含至少一個氨基酸置換突變。這里，改造的klenow片段氨基酸序列上的氨基酸位置編號，以dna聚合酶i(uniprotkb登錄號：p00582，https://www.uniprot.org/uniprot/p00582)為基準，如f762，表示該改造的klenow片段氨基酸序列上對應于dna聚合酶i的氨基酸序列的第762位的f(苯丙氨酸)存在突變。
4、在一些示例中，所稱的氨基酸置換突變選自功能相當于f762y、a842k、a842h、a842r、i709k、i709h、i709r和p603k置換突變中的至少一種。在一些示例中，例如，該改造的klenow片段的錯義突變為下列1)-14)中的任意一種：1)f762y；2)a842k；3)i709k；4)f762y和a842k；5)f762y、a842k和p603k；6)a842k和i709k；7)f762y和i709k；8)f762y、a842k和i709k；9)a842h和i709k；10)a842k和i709h；11)a842h和i709h；12)a842r和i709k；13)a842k和i709r；14)a842r和i709r。在另一些示例中，該改造的klenow片段為混合酶，例如為上述具有1)-14)中的兩種或者兩種以上的改造的klenow片段的混合物。
5、本專利技術這一方面提供的改造的klenow片段均具有較高的合成能力包括較快的合成速度和/或與底物較高的親和力，應用于測序時，表現出與修飾的核苷酸和/或生長的dna鏈有較強的兼容性，利于獲得更長的讀長和/或提高高質量數據的占比。
6、關于突變的命名規則，本文采用本領域公認的人類基因組變異協會制定的規則(hgvs突變命名規則)，如p.trp26cys，表示以蛋白質為參考序列、第26位的trp被cys取代；如無特別說明，本文提及的突變均為氨基酸突變，參考序列為蛋白質，書面表示該些突變時，均省略“p.”。
7、可以理解地，相同功能的突變可以有多種不同的表示方式，例如，以不同類型的參考序列為基準，如以基因組dna和以蛋白質為參考序列，相同的突變具有不同的表示方式，再例如，以相同蛋白的一部分或者全部作為參考序列，突變的位置編號可能不同；依據具體參考序列信息，本領域人員能夠知曉和識別出不同表示方式包括以不同位置編號表示的相同功能位置的相同突變，該些以不同表示方式表示與本專利技術該方面提供的相同突變的改造的klenow片段，均屬于本專利技術該方面所稱的改造的klenow片段。
8、為了直觀顯示專利技術人經過突變、測試、來回篩選驗證后而提供的改造的klenow片段的性能，在一些示例中，將該(些)改造的klenow片段和商業化的klenow片段分別應用于測序，進行結果對比，所稱的商業化的klenow酶包括neb公司的klenow片段(neb公司，貨號m0407b)和vazyme公司的klenow片段(諾唯贊公司，貨號n105-c1)；另外，通過試驗測試該(些)改造的klenow片段的特性，并與野生型klenow片段的進行對比。
9、所稱的野生型klenow片段同一般所說的野生型，相對于突變型，指自然群體中最常見的類型；在一些示例中，為利于制備在野生型氨基酸序列的末端引入一段不影響酶反應性能的已知序列的klenow片段，該帶有一段已知序列的klenow片段，也稱為野生型或帶標簽的野生型klenow片段；在一些示例中，為利于制備在改造的klenow片段氨基酸序列的末端引入一段不影響酶反應性能的已知序列的改造的klenow片段，該帶有一段已知序列的改造的klenow片段，也稱為改造的klenow片段或帶標簽的改造的klenow片段或帶標簽的突變型klenow片段。
10、所稱的測序，指的是利用klenow片段的反應性能將帶有可檢測信號的核苷酸連接至核苷酸片段末端，并根據檢測到的可檢測信號種類確認連接的核苷酸或堿基的種類，所稱的可檢測信號包括熒光信號，如cy5，cy3等。
11、在下文涉及的酶的性能包括應用于測序獲得的效果的描述中，如無例外說明，所稱的brr(base?repeat?ratio)為重復堿基比例，表示被檢測到連續發出信號或者連續發出一種信號的某個待檢測位置對應的堿基數目占堿基總數的比例。出于正常序列包含多個連續重復堿基是少見的來定義該術語，例如，正常序列包含一段或多段包含5個或5個以上連續重復堿基，是很少見的，確定該定義的術語的數值大小能一定程度上反映測得的數據為客觀/真實的可能性大小。測序一般包括多輪反應(cycle)以能測定出一段具有特定長度的序列(讀段)，定義完成一次四種核苷酸的堿基本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種改造的Klenow片段，其特征在于，所述改造的Klenow片段用于核酸測序，以DNA聚合酶I為基準，所述改造的Klenow片段氨基酸序列存在氨基酸置換突變，且所述氨基酸突變為A842K和I709K的置換突變。
2.根據權利要求1所述的改造的Klenow片段，其特征在于，所述改造的Klenow片段氨基酸序列的至少一個末端帶有一段長度小于12aa的已知序列；
3.一種核酸分子，所述核酸分子編碼如權利要求1或2所述的改造的Klenow片段。
4.一種表達載體，所述表達載體包含權利要求3所述的核酸分子。
5.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求4所述的載體。
6.一種使核苷酸結合到DNA中的方法，其特征在于，包括(a)如權利要求1-2任一所述的改造的Klenow片段或者改造的Klenow片段的混合物、(b)DNA和(c)核苷酸溶液發生相互作用。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述(c)核苷酸溶液包含的核苷酸為帶有熒光分子標記的核苷酸；
8.一種用于使核苷酸結合到DNA中的試劑盒，包括
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括核苷酸溶液；
10.權利要求8或9所述的任一試劑盒在核酸序列延伸反應的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種改造的klenow片段，其特征在于，所述改造的klenow片段用于核酸測序，以dna聚合酶i為基準，所述改造的klenow片段氨基酸序列存在氨基酸置換突變，且所述氨基酸突變為a842k和i709k的置換突變。
2.根據權利要求1所述的改造的klenow片段，其特征在于，所述改造的klenow片段氨基酸序列的至少一個末端帶有一段長度小于12aa的已知序列；
3.一種核酸分子，所述核酸分子編碼如權利要求1或2所述的改造的klenow片段。
4.一種表達載體，所述表達載體包含權利要求3所述的核酸分子。
5.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求4...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳清斌，陳巍月，李紅丹，林霞，王文，駱瑋瑋，孫雷，
申請(專利權)人：深圳市真邁生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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