【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種表達雙特異抗體的溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137及構建方法和應用，屬于病毒微生物。
技術介紹
1、惡性腫瘤是威脅人類生命健康的重要疾病。近年來隨著手術、化療、放療和靶向治療等治療方案的不斷進步，腫瘤患者的生存期得到延長，但是，仍有大量晚期腫瘤患者面臨著無藥可用的尷尬地步。因此，臨床上亟需探索新的行之有效的治療方法和藥物用于實體瘤治療。
2、臨床上，使用抗pd-1/pd-l1抗體阻斷pd-1與pd-l1結合，恢復腫瘤特異性t細胞免疫功能清除腫瘤的方法，已被批準用于治療多個腫瘤類型并獲得成功，如：非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、黑素瘤和霍奇金淋巴瘤等。然而在卵巢癌中，抗pd-1/pd-l1單一藥物治療的客觀應答率僅為6-15％，可以說幾乎無效。
3、抗pd-1/pd-l1治療效果取決于腫瘤微環境中腫瘤特異性t細胞。腫瘤特異性t細胞活化與腫瘤基因突變產生的特異性“新抗原”，和抗原遞呈細胞dc對“新抗原”遞呈能力高度相關。研究發現，在大多數卵巢癌中腫瘤基因突變負荷(tumor?mutation?burden?tmb)普遍處于低水平，其結果是產生的腫瘤特異性“新抗原”少，導致腫瘤特異性t細胞不能被識別活化。除此之外，卵巢癌還能通過多個途徑誘導抗原遞呈細胞dc等功能障礙，導致腫瘤“新抗原”不能被t細胞識別，阻止腫瘤特異性t細胞活化和擴增。由于上述因素的共同作用，導致卵巢癌中缺乏腫瘤特異性t細胞，使得抗pd-1/pd-l1的治療在卵巢癌中面臨客觀有效率低的問題。因此，如何促進腫瘤“新抗原”被免
4、溶瘤病毒是一類在腫瘤細胞內選擇性復制并發生溶瘤作用的病毒的統稱，該類病毒在正常組織細胞中低復制或不復制，不發生細胞毒性作用。常見的溶瘤病毒主要有溶瘤腺病毒(adenovirus,adv)、單純皰疹病毒1型(herpes?simplex?virus,hsv-1)、麻疹病毒(measles?virus,mv)、水皰性口炎病毒(vesicμlar?stomatitis?virus,vsv)、痘苗病毒(vaccinia?virus,vv)和新城疫病毒(newcastle?disease?virus,ndv)等。近十多年來，人們逐漸發現，溶瘤病毒不僅能夠直接導致腫瘤細胞死亡(溶瘤)，還能夠有效打破腫瘤免疫耐受并誘導抗腫瘤免疫反應。越來越多的證據表明，溶瘤病毒的抗腫瘤作用主要依賴于其誘導的免疫溶瘤，而不是病毒的單純溶瘤作用。溶瘤病毒誘導的免疫溶瘤作用，不僅通過上調腫瘤局部的細胞因子和趨化因子來活化免疫細胞，更重要的是通過誘導腫瘤免疫原性細胞死亡(icd)，釋放一類損傷模式相關分子(damp)等危險信號，打破腫瘤微環境的免疫耐受，誘導免疫細胞對腫瘤細胞的識別與攻擊。溶瘤病毒這種免疫溶瘤作用還能夠通過多個途徑增強抗原遞呈細胞dc的功能，遞呈“新抗原”給t細胞，活化并擴增腫瘤特異性t細胞，誘導特異性抗腫瘤免疫。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術提供一種表達雙特異抗體的溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137及構建方法和應用。
2、為了實現上述目的，本專利技術所采用的技術方案：
3、一種表達anti-pd-l1/anti-cd137雙特異抗體的溶瘤病毒，將apdl1/acd137片段與vsv病毒基因組質粒連接，得到病毒全基因組質粒pt7-vsv-apdl1/acd137；該質粒與輔助質粒共轉染至293t細胞，培養后獲得vsv-apdl1/acd137病毒種子；將病毒種子使用293t細胞大量擴增，得到溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137。
4、所述溶瘤病毒的構建方法包括以下步驟：
5、(1)apdl1/acd137片段的設計：將anti-pd-l1的高變區組成的單鏈抗體apdl1與anti-cd137的高變區組成的單鏈抗體acd137通過linker序列連接，融合成雙特異抗體apdl1/acd137；在apdl1/acd137的n端引入igg重鏈信號肽，c端引入his標簽；
6、所有序列按設計拼接后進行密碼子優化，優化后的核酸序列全基因合成插入t載體，得到puc-apdl1/acd137；
7、(2)溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137全基因組質粒pt7-vsv-apdl1/acd137的克隆：以puc-apdl1/acd137為模板，以vsv?f：taatcagaattctcgagaccgccaccatggactggac和vsv?r：agtttttttcatatggccatcagtggtggtggtggtg為引物，使用高保真試劑盒擴增apdl1/acd137片段，并在apdl1/acd137片段的兩端引入與vsv全基因組插入位置同源的序列片段，即兩邊各插入16個同源堿基；
8、將pt7-vsv全基因組質粒使用msci和xhoi雙酶切，然后純化，獲得線性的pt7-vsv全基因組質粒，將apdl1/acd137片段與雙酶切后的全基因組質粒pt7-vsv連接，得到病毒全基因組質粒pt7-vsv-apdl1/acd137；
9、(3)溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137的拯救：使用lipofectamine2000轉染試劑將pt7-vsv-apdl1/acd137與輔助質粒共轉染至293t細胞，然后置于37℃、5％?co2細胞培養箱中培養4-6小時，然后補加含2％?fbs的dmem細胞培養基2ml，繼續培養2-3天，根據培養基情況，更換或補充2％?fbs的dmem，每天顯微鏡下觀察細胞狀態，4-8天出現細胞病變并至細胞病變100％時收集細胞上清，離心去除細胞碎片，即得到溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137，分裝后置于-80℃保存。
10、所述步驟(3)，pt7-vsv-apdl1/acd137用量為5μg，輔助質粒為pvrc-t7、pvrc-n、pvrc-p和pvrc-l，其用量均為0.5μg。
11、所述表達anti-pd-l1/anti-cd137雙特異抗體的溶瘤病毒在制備用于卵巢癌治療的藥物中的應用。
12、所述表達anti-pd-l1/anti-cd137雙特異抗體的溶瘤病毒在制備治療實體瘤的藥物中的應用。
13、本專利技術的有益效果：
14、本專利技術的表達anti-pd-l1/anti-cd137雙特異抗體的溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137，具有以下技術效果：
15、(1)本專利技術的溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137通過溶瘤作用殺死腫瘤細胞，降低腫瘤負荷，溶瘤病毒殺死腫瘤細胞的同時釋放多種活化免疫相關因子，招募淋巴細胞向腫瘤組織浸潤，激活特異性抗腫瘤免疫。
16、(2)本專利技術的溶瘤病毒vs本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種表達anti-PD-L1/anti-CD137雙特異抗體的溶瘤病毒，其特征在于，將aPDL1/aCD137片段與VSV病毒基因組質粒連接，得到病毒全基因組質粒pT7-VSV-aPDL1/aCD137；該質粒與輔助質粒共轉染至293T細胞，培養后獲得VSV-aPDL1/aCD137病毒種子；將病毒種子使用293T細胞大量擴增，得到溶瘤病毒VSV-aPDL1/aCD137。
2.一種權利要求1所述的溶瘤病毒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.如權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述步驟(3)中，pT7-VSV-aPDL1/aCD137的用量為5μg，輔助質粒為pVRC-T7、pVRC-N、pVRC-P和pVRC-L，其用量均為0.5μg。
4.一種權利要求1所述的表達anti-PD-L1/anti-CD137雙特異抗體的溶瘤病毒在制備用于卵巢癌治療的藥物中的應用。
5.一種權利要求1所述的表達anti-PD-L1/anti-CD137雙特異抗體的溶瘤病毒在制備治療實體瘤的藥物中的應用。
【技術特征摘要】
1.一種表達anti-pd-l1/anti-cd137雙特異抗體的溶瘤病毒，其特征在于，將apdl1/acd137片段與vsv病毒基因組質粒連接，得到病毒全基因組質粒pt7-vsv-apdl1/acd137；該質粒與輔助質粒共轉染至293t細胞，培養后獲得vsv-apdl1/acd137病毒種子；將病毒種子使用293t細胞大量擴增，得到溶瘤病毒vsv-apdl1/acd137。
2.一種權利要求1所述的溶瘤病毒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
3....
【專利技術屬性】
技術研發人員：張永輝，李亞龍，張玉薇，袁蒙蒙，劉廣芝，程朝飛，袁梅金，應瑞瓊，
申請(專利權)人：河南省人民醫院，
類型：發明
國別省市：
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