【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及海洋生物蛋白肽領(lǐng)域，特別是一種高活性魷魚(yú)皮抗氧化肽及其制備方法。
技術(shù)介紹
1、抗氧化肽作為一種天然抗氧化劑因其分子量低、活性高、易于吸收、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)，兼具營(yíng)養(yǎng)性和降血壓、提高免疫等功能性受到廣泛關(guān)注?？寡趸囊?yàn)榉稀疤烊?、安全、無(wú)毒、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高”等特點(diǎn)在食品領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，已成為功能食品中使用率最高的天然產(chǎn)物之一。利用低成本生物資源開(kāi)發(fā)具有營(yíng)養(yǎng)性、安全性的抗氧化肽一直是多肽領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
2、魷魚(yú)，又名柔魚(yú)、槍烏賊，屬于軟體動(dòng)物門(mén)，頭足綱，鞘亞綱，十腕總綱管，魷目，開(kāi)眼亞目，是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和海洋食品。2020年，我國(guó)魷魚(yú)捕獲量達(dá)到29.56萬(wàn)噸，產(chǎn)量也在不斷增加，在魷魚(yú)加工中，會(huì)產(chǎn)生30％左右魷魚(yú)副產(chǎn)物，主要魷魚(yú)皮、魷魚(yú)墨汁、魷魚(yú)軟骨、魷魚(yú)內(nèi)臟等，目前大部分魷魚(yú)加工副產(chǎn)物沒(méi)有得到有效利用或被丟棄，造成嚴(yán)重的資源浪費(fèi)及環(huán)境污染。魷魚(yú)皮約占魷魚(yú)副產(chǎn)物總量的8％～13％，富含大量蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)約占魷魚(yú)皮干重的88％左右，其中膠原蛋白含量約占魷魚(yú)皮蛋白質(zhì)的50％，是良好的潛在生物活性肽來(lái)源。
3、生物信息學(xué)工具輔助篩選活性肽，是基于活性肽中已知的氨基酸序列，利用數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和軟件分析，對(duì)肽段可能的生物活性、安全性及生物可及性等性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取目標(biāo)肽段化學(xué)合成并對(duì)其相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)生物信息學(xué)工具可節(jié)省大量時(shí)間成本和實(shí)驗(yàn)成本。keap1-nrf2通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)超過(guò)600個(gè)相關(guān)的基因以維持細(xì)胞氧化還原平衡和代謝，是機(jī)體應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的重要信號(hào)通路之一。近年來(lái)，同源性建模和分子對(duì)接
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供一種利用生物信息學(xué)方式篩選出的高活性魷魚(yú)源抗氧化肽。
2、本專利技術(shù)所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供一種上述高活性魷魚(yú)源抗氧化肽的制備方法。
3、本專利技術(shù)所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供一種上述高活性魷魚(yú)源抗氧化肽的篩選方法。
4、本專利技術(shù)所要解決的第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀而提供一種上述高活性魷魚(yú)源抗氧化肽的應(yīng)用。
5、本專利技術(shù)解決上述第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種高活性魷魚(yú)皮抗氧化肽，該抗氧化肽的氨基酸序列g(shù)ln-asp-gly-phe-gln-gly-ala-his或者ser-gly-asp-asn-leu-arg-phe-pro。
6、本專利技術(shù)解決上述第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種上述魷魚(yú)皮抗氧化肽的制備方法，包括以下步驟：
7、(1)魷魚(yú)皮的前處理
8、取魷魚(yú)皮攪碎處理后用紗布吸干水分，得到魷魚(yú)皮碎末；
9、(2)高活性酶解產(chǎn)物的制備
10、將步驟(1)所得魷魚(yú)皮碎末用緩沖液配制為懸濁液，加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解完畢后收集上清液，得到酶解產(chǎn)物；
11、(3)高活性酶解產(chǎn)物的分離
12、對(duì)步驟(2)制備得到的酶解產(chǎn)物通過(guò)凝膠柱進(jìn)行分離，對(duì)各分離級(jí)分的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，得到最高活性分離級(jí)分。
13、優(yōu)選地，步驟(2)中所述的緩沖液的ph為8.0～10.0，并使用該緩沖液將步驟(1)所得魷魚(yú)皮碎末配制成料液比為1:1～7的懸濁液，加入按底物質(zhì)量計(jì)為1500～3500u/g的堿性蛋白酶，然后在40～60℃下酶解1～5h得到酶解液，最后將酶解液在95～100℃的溫度下保溫15～25min，冷卻后在8000～10000r/min的條件下離心并收集上清液，上清液經(jīng)濃縮凍干即得酶解產(chǎn)物。
14、優(yōu)選地，步驟(2)中所述的緩沖液的ph為10，并使用該緩沖液將步驟(1)所得魷魚(yú)皮碎末配制成料液比為1:4.5的懸濁液，加入按底物質(zhì)量計(jì)為2625u/g的堿性蛋白酶，然后在40℃下酶解4.5h得到酶解液，最后將酶解液在100℃的溫度下保溫15min，冷卻后在10000r/min的條件下離心并收集上清液，上清液經(jīng)濃縮凍干即得酶解產(chǎn)物。
15、優(yōu)選地，步驟(3)中所述凝膠柱為sephadex?g-15凝膠層析柱，對(duì)所述酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化的具體條件為：洗脫液為純水，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，上樣量為100mg，流速為0.5ml/min。
16、本專利技術(shù)解決上述第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種高活性魷魚(yú)皮抗氧化肽的篩選方法，對(duì)上述的制備方法得到的最高活性分離級(jí)分進(jìn)行篩選，所述篩選方法包括以下步驟：
17、(4)對(duì)所述最高活性分離級(jí)分進(jìn)行序列鑒定，得到魷魚(yú)皮肽序列組；
18、(5)將步驟(4)鑒定出的魷魚(yú)皮肽序列組與keap1蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，篩選出活性高的魷魚(yú)皮肽序列。
19、優(yōu)選地，步驟(4)中，所述序列鑒定的具體過(guò)程為：通過(guò)lc-ms/ms對(duì)最高活性分離級(jí)分進(jìn)行測(cè)定，再采用denovo的方法進(jìn)行序列解析。
20、優(yōu)選地，步驟(5)中采用keap1蛋白kelch區(qū)域16mer?nrf2結(jié)合的pdb文件2flu作為對(duì)接的受體文件，并進(jìn)行預(yù)處理定義其活性中心坐標(biāo)為x＝5，y＝9，z＝1，活性中心半徑為9.5a。
21、優(yōu)選地，步驟(5)中，魷魚(yú)皮肽序列組中的每一個(gè)序列均作為配體，所有配體結(jié)構(gòu)由chem3d生成，利用charmm力場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行能量最小化處理。
22、優(yōu)選地，步驟(5)中，將受體與配體進(jìn)行cddock對(duì)接，篩選與keap1蛋白-cddockenergy值高的魷魚(yú)皮肽序列。
23、本專利技術(shù)解決上述第四個(gè)技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種上述的魷魚(yú)皮抗氧化肽在制備食品添加劑或日化用品中的應(yīng)用。
24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于：
25、(1)本專利技術(shù)從魷魚(yú)皮中篩選的抗氧化肽的抗氧化活性良好且無(wú)細(xì)胞毒性；
26、(2)本專利技術(shù)經(jīng)admet預(yù)測(cè)，該魷魚(yú)皮抗氧化肽無(wú)毒副作用，且具有腸道吸收能力，經(jīng)peptide?ranker預(yù)測(cè)，該魷魚(yú)皮抗氧化肽具有體內(nèi)生物活性，且穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明該魷魚(yú)皮抗氧化肽在酸、熱環(huán)境中活性保持在70％以上，因而具有較好應(yīng)用前景；
27、(3)本專利技術(shù)利用分子對(duì)接和數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的模擬方式在343條肽序列中精準(zhǔn)篩選到具有高抗氧化活性且無(wú)毒性的魷魚(yú)皮抗氧化肽序列，簡(jiǎn)化了篩選過(guò)程、極大地節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本；
28、(4)本專利技術(shù)所采用的原料為海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)類魷魚(yú)的加工廢棄物，有效避免了環(huán)境污染，提高了資源利用率。
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1.一種高活性魷魚(yú)皮抗氧化肽，其特征在于，該抗氧化肽的氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Phe-Gln-Gly-Ala-His或者Ser-Gly-Asp-Asn-Leu-Arg-Phe-Pro。
2.一種如權(quán)利要求1所述魷魚(yú)皮抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的緩沖液的pH為8.0～10.0，并使用該緩沖液將步驟(1)所得魷魚(yú)皮碎末配制成料液比為1:1～7的懸濁液，加入按底物質(zhì)量計(jì)為1500～3500U/g的堿性蛋白酶，然后在40～60℃下酶解1～5h得到酶解液，最后將酶解液在95～100℃的溫度下保溫15～25min，冷卻后在8000～10000r/min的條件下離心并收集上清液，上清液經(jīng)濃縮凍干即得酶解產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的緩沖液的pH為10，并使用該緩沖液將步驟(1)所得魷魚(yú)皮碎末配制成料液比為1:4.5的懸濁液，加入按底物質(zhì)量計(jì)為2625U/g的堿性蛋白酶，然后在40℃下酶解4.5h得到酶解液，最后將酶解液在100℃的溫度
5.根據(jù)權(quán)利2所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述凝膠柱為Sephadex?G-15凝膠層析柱，對(duì)所述酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化的具體條件為：洗脫液為純水，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，上樣量為100mg，流速為0.5mL/min。
6.一種高活性魷魚(yú)皮抗氧化肽的篩選方法，其特征在于，對(duì)權(quán)利要求2～5任意一項(xiàng)所述的制備方法得到的最高活性分離級(jí)分進(jìn)行篩選，所述篩選方法包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利6所述的篩選方法，其特征在于，步驟(4)中，所述序列鑒定的具體過(guò)程為：通過(guò)LC-MS/MS對(duì)最高活性分離級(jí)分進(jìn)行測(cè)定，再采用Denovo的方法進(jìn)行序列解析。
8.根據(jù)權(quán)利6所述的篩選方法，其特征在于，步驟(5)中采用Keap1蛋白Kelch區(qū)域16merNrf2結(jié)合的PDB文件2FLU作為對(duì)接的受體文件，并進(jìn)行預(yù)處理定義其活性中心坐標(biāo)為X＝5，Y＝9，Z＝1，活性中心半徑為9.5A；魷魚(yú)皮肽序列組中的每一個(gè)序列均作為配體，所有配體結(jié)構(gòu)由Chem3D生成，利用CHARMm力場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行能量最小化處理。
9.根據(jù)權(quán)利8所述的篩選方法，其特征在于，步驟(5)中，將受體與配體進(jìn)行CDDOCK對(duì)接，篩選與Keap1蛋白-CDDOCK?Energy值高的魷魚(yú)皮肽序列。
10.一種如權(quán)利要求1所述的魷魚(yú)皮抗氧化肽在制備食品添加劑或日化用品中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種高活性魷魚(yú)皮抗氧化肽，其特征在于，該抗氧化肽的氨基酸序列g(shù)ln-asp-gly-phe-gln-gly-ala-his或者ser-gly-asp-asn-leu-arg-phe-pro。
2.一種如權(quán)利要求1所述魷魚(yú)皮抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的緩沖液的ph為8.0～10.0，并使用該緩沖液將步驟(1)所得魷魚(yú)皮碎末配制成料液比為1:1～7的懸濁液，加入按底物質(zhì)量計(jì)為1500～3500u/g的堿性蛋白酶，然后在40～60℃下酶解1～5h得到酶解液，最后將酶解液在95～100℃的溫度下保溫15～25min，冷卻后在8000～10000r/min的條件下離心并收集上清液，上清液經(jīng)濃縮凍干即得酶解產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的緩沖液的ph為10，并使用該緩沖液將步驟(1)所得魷魚(yú)皮碎末配制成料液比為1:4.5的懸濁液，加入按底物質(zhì)量計(jì)為2625u/g的堿性蛋白酶，然后在40℃下酶解4.5h得到酶解液，最后將酶解液在100℃的溫度下保溫15min，冷卻后在10000r/min的條件下離心并收集上清液，上清液經(jīng)濃縮凍干即得酶解產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利2所述的制備方法，其特征在于，...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戚向陽(yáng)，陳峰，曹少謙，劉合生，盛宇琳，楊華，顏金鑫，阮帝，華正好，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：浙江萬(wàn)里學(xué)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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