【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及林木種質資源離體保存方法，具體涉及一種松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法。
技術介紹
0、技術背景
1、互葉白千層(melaleuca?alternefolia)，原產澳大利亞，又名澳洲茶樹，是桃金娘科白千層屬一種重要的藥用和香料用經濟樹種。其枝葉提取的精油，即澳洲茶樹油(teatree?oil，簡稱tto)享譽世界，被譽為“澳洲黃金”，具有消炎、殺菌、止血、鎮痛、祛痱止癢，控油祛痘，驅蚊及免疫激活、抗氧化、抗癌等功效，廣泛應用于制藥、生物農藥、日化、食品行業，具有極高的經濟價值(yadav?et?al.,2016；chidi?et?al.,2020；lee?et?al.,2020；redondo-blanco?et?al.,2020)。
2、互葉白千層在20世紀90年代引種到中國，由于種子極其細小，且多敗育，發芽率低，種間分化明顯，優良家系種苗匱乏，導致精油品質不穩定，嚴重制約了其發展(郭逸成，2007；周麗華等，2001)。
3、超低溫保存能夠以最小的成本、最大化的長期保存優良基因，是目前種質資源長期保存的理想方法。超低溫保存，是將生物材料保存在-80℃以下(通常為液氮)的生物技術(engelmann,2004；baust,2002)。植物細胞在如此低的溫度下新陳代謝過程基本停止，并能最大限度保持材料的遺傳穩定性，具有長期性和穩定性的優點，而且能在極小的空間儲存大量材料，省地省工，經濟有效，是目前種質資源保存最安全經濟的選擇(wang?et?al.,2012；oz
4、因此，嚴格把握cpa保護與毒害作用之間的平衡，適當的脫水并使細胞進入玻璃化狀態，預防和緩解cpa產生的氧化損傷對于超低溫保存成功至關重要。cpa包括滲透性的乙二醇等，和非滲透性的大分子物質如聚丙烯吡咯酮(pvp)，聚蔗糖(ficoll)和葡聚糖(dextran)以及一些小分子糖類等。在滲透脫水的同時，cpa進入細胞內部改變了細胞液體的熱力學性質，快速降溫時可以實現胞內和胞外的玻璃化，保持細胞結構的完整和再生能力，實現了對一些熱帶植物的保存。
5、互葉白千層主要在南方少數幾個省份種植，生產實踐及科學實驗表明，對水分要求比較高，耐水淹，不耐脫水，不耐寒，即使是移栽一個月長約30cm的組培苗在0℃低溫脅迫48h，葉色即變黃，葉片干枯；-5℃脅迫24h即受到不可逆損傷。回復常溫培養，不能回復生長。因此，對較不耐寒的松油烯-4醇型無菌莖尖的超低溫保存無論從生產、科研還是種質資源安全方面來講，都具有重要意義且從技術層面來講具有相當大的挑戰性。
技術實現思路
1、針對上述問題，本專利技術公開了一種松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖超低溫保存的方法，包括無菌莖尖的獲取、預培養、脫水、冷凍、化凍及回復培養等工序。當生產用的組培苗繼代到一定次數，出現“衰老”現象時，利用該方法隨時取出液氮中保存的無菌莖尖進行快速繼代增殖，在保證遺傳變異最小化的同時，大大節約了外植體消毒，初代培養等時間及人力成本。采集繼代4-15代的增殖芽，經過一定的預處理快速獲取大小一致、穩定性較好的無菌莖尖，然后經預培養提高材料的抗逆性，再添加抗凍劑、抗氧化物質脫水，進行玻璃化法冷凍，最后置于液氮中保存。通過本專利技術技術，冷凍保存后的莖尖分生組織在解凍后2-3周內由黑轉綠，4-5周內回復正常生長，實現了不耐寒互葉木本植物互葉白千層莖尖的超低溫保存，對于其種質資源保存和利用以及冷凍保存機理的進一步研究具有重要意義。
2、為了實現以上技術目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、一種松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，包括以下步驟：
4、(1)無菌莖尖的獲取：以上述建立的組培試管苗為材料，取繼代30-45d的高度在4-5cm的松油烯-4醇型-互葉白千層組培苗簇，切割成單株，置于增殖培養基1培養10-20d，前3-5d遮光處理，后逐漸增加光照，溫度25-30℃；待長出腋芽，長度為1-3mm時，利用無菌手術刀片和不銹鋼高精密度超尖工藝鑷子切去莖底端多余組織，保留莖尖分生組織和2-5片葉原基，切割成1-3mm；
5、(2)無菌莖尖的預處理：將無菌莖尖置于培養基2，于培養箱培養3-4d；
6、(3)無菌莖尖的裝載：采用甘油+蔗糖裝載20-30min；
7、(4)無菌莖尖的脫水：將莖尖置于含1.5-2ml優化的pvs2溶液的冷凍管中2-6℃預冷，然后以150-250rpm的速度震蕩脫水40-60min；
8、(5)冷凍保存：將莖尖裝于冷凍保存管投入液氮保存48h以上；
9、(6)38-42℃水浴快速化凍1-2min；
10、(7)采用蔗糖卸載20-26min；
11、(8)回復培養將莖尖轉移到回復培養基回復培養15-30d，莖尖由黑轉綠，繼續培養，可獲得再生植株。
12、優選地，步驟(1)中所述的繼代30-45d的組培苗簇為繼代次數在4-15代的組培苗。
13、優選地，步驟(1)中所述的增殖培養基1：改良ms+6-芐氨基腺嘌呤2.0-4.0mg/l+萘乙酸0.5-1.0mg/l+蔗糖30000-80000mg/l+瓊脂3500-4500mg/l+0-100g/l聚乙二醇peg-8000+100ug/ml原花青素b2+0-0.1g/l谷胱甘肽。
14、優選地，步驟(2)中所述的培養基2配方為：改良ms+0.25g/l活性炭+0.03g/l核黃素+50g/l聚乙二醇peg-8000+0.05g/l谷胱甘肽+50g/l二甲基亞砜+102.6g/l蔗糖。
15、優選地，步驟(2)中所述的培養條件為：溫度為4-10℃，光照度為7000-9000lux。
16、優選地，步驟(3)中所述的甘油濃度為1.8-2.2m。
17、優選地，步驟(3)中所述的蔗糖的濃度為0.4-0.5m。
18、優選地，步驟(4)中所述的優化的pvs2配方為1本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(1)中所述的繼代30-45d的組培苗簇為繼代次數在4-15代的組培苗。
3.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(1)中所述的增殖培養基1：改良MS+6-芐氨基腺嘌呤2.0-4.0mg/L+萘乙酸0.5-1.0mg/L+蔗糖30000-80000mg/L+瓊脂3500-4500mg/L+0-100g/L聚乙二醇PEG-8000+
4.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(2)中所述的培養基2配方為：改良MS+0.25g/L活性炭+0.03g/L核黃素+50g/L聚乙二醇PEG-8000+0.05g/L谷胱甘肽+50g/L二甲基亞砜+102.6g/L蔗糖。
5.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(2)中所述的培養條件為：
6.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(3)中所述的甘油濃度為1.8-2.2M。
7.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(3)中所述的蔗糖的濃度為0.4-0.5M。
8.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(4)中所述的優化的PVS2配方為10％椰子水+300g/L甘油+130g/L蔗糖+100g/L乙二醇+75g/L二甲基亞砜。
9.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(7)中所述的蔗糖的濃度為1.1-1.3M。
10.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(8)中所述的回復培養基配方為：改良MS+6-芐氨基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.5mg/L+蔗糖30000mg/L+瓊脂3500mg/L+100ug/ml原花青素B2+谷胱甘肽0.05g/L+10％椰子水。
...【技術特征摘要】
1.一種松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(1)中所述的繼代30-45d的組培苗簇為繼代次數在4-15代的組培苗。
3.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(1)中所述的增殖培養基1：改良ms+6-芐氨基腺嘌呤2.0-4.0mg/l+萘乙酸0.5-1.0mg/l+蔗糖30000-80000mg/l+瓊脂3500-4500mg/l+0-100g/l聚乙二醇peg-8000+
4.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(2)中所述的培養基2配方為：改良ms+0.25g/l活性炭+0.03g/l核黃素+50g/l聚乙二醇peg-8000+0.05g/l谷胱甘肽+50g/l二甲基亞砜+102.6g/l蔗糖。
5.根據權利要求1所述的松油烯-4醇型互葉白千層無菌莖尖的冷凍保存方法，其特征在于，步驟(2)中所述的培養條件為：溫度為4-10℃，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張曉寧，劉海龍，張燁，覃子海，肖玉菲，魏秋蘭，鐘連香，林東，
申請(專利權)人：廣西壯族自治區林業科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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