【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于單細胞分析，具體涉及一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法。
技術介紹
1、單細胞分析(single-cell?analysis)是指在單細胞水平上研究細胞的基因組、轉錄組、蛋白質組、表觀遺傳組和代謝組等多方面和多組學的特征，以揭示個體細胞之間的異質性。與傳統的群體分析(bulk?analysis)不同，后者通常是在多細胞或組織水平獲得細胞總體的平均狀態，無法明確細胞間關鍵的異質性信息。單細胞分析技術能對每個細胞進行單獨測量，識別獨特特征，獲得遺傳信息，從而揭示每個細胞的基因結構和表達狀態，反映出傳統群體分析所無法得到的細胞異質性信息和稀有細胞的遺傳信息。目前，單細胞分析已廣泛應用于發育、穩態和疾病等研究領域。
2、細胞在生命過程中會經歷不同的狀態轉換。常規的單細胞分析通常需要將單細胞進行裂解并捕獲其靜態瞬時的基因表達信息，而單細胞分子水平的異質性往往會隨時間發生動態變化。例如，基因的表達是從dna轉錄為mrna，而不同環境因素刺激和各種信號通路的激活都會引起特定基因的轉錄活性的動態變化。因此，捕捉細胞在基因表達層面發生的動態變化，成為單細胞動態分析的研究熱點。
3、時間分辨的單細胞轉錄組動態分析是一種對單細胞轉錄組時間演變進行跟蹤和分析的技術，能夠揭示基因表達隨時間變化的動態過程。這種分析不僅關注某個時間點上的基因表達狀態，還研究在發育過程中、細胞周期中或響應外界刺激時基因表達隨時間的動態變化。在研究基因表達的動態分析中，特定時間內“新生成的rna”更值得關注。新生rna(nascent?rna
4、目前，在單細胞水平研究新生rna動態變化的分析方法已相對成熟，但以時間和空間分辨率兩個維度來解析基因表達和細胞功能的動態分析策略仍比較有限?，F有的時間分辨單細胞轉錄組分析方法主要包括：(1)擬時序分析技術，利用單細胞轉錄組測序數據來推測細胞軌跡，但基于統計學的假設可能與實際細胞生命過程不符，對于基因轉錄速率的估計長期依賴于模型，可能受到模型假設和算法的影響；(2)基于胞漿內容物的測序技術的時間分辨單細胞檢測方法，可在多時間點對單個細胞的rna進行提取和測序，但該方法細胞分析通量低，無法實現較高測序通量；(3)結合代謝標記及高通量測序的新生rna分析方法，將新生rna帶上4su和5-eu的標簽，從而可以區分新舊rna，然而該方法無法保留rna的空間分布信息，并且實驗步驟往往復雜；(4)結合代謝標記和原位測序的時空轉錄組分析技術，通過標記和原位測序新生成的rna，追蹤rna的動態變化，但該方法mrna檢測效率較低。
5、因此，尚缺乏高靈敏度、高準確度、高通量的時空分辨單細胞轉錄組分析方法。開發這樣的技術對于深入理解細胞狀態的動態變化和細胞功能的空間分布具有重要意義，將為細胞生物學研究和疾病診斷提供強大的工具。
技術實現思路
1、本專利技術目的在于克服現有技術缺陷，提供一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法。
2、本專利技術的技術方案如下：
3、一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，包括如下步驟，如圖1所示：
4、(1)用5-乙炔基尿苷代謝標記貼壁培養的細胞，然后對細胞進行固定、透化和清洗；
5、(2)用5’端具有能夠與5-乙炔基尿苷發生共價結合的修飾基團的dna探針probe?b與經步驟(1)處理的細胞中的5-乙炔基尿苷進行點擊化學反應；
6、(3)在步驟(2)所得的反應產物中加入至少一dna探針probe?a與目標基因的mrna互補配對；
7、(4)在步驟(3)所得的反應產物中加入至少一環狀dna探針circle?1和環狀dna探針circle?2進行成環互補配對，該至少一環狀dna探針circle?1帶有特異性編碼且5’端帶有磷酸基團修飾，該環狀dna探針circle?2的5’端帶有磷酸基團修飾，至少一環狀dna探針circle?1和環狀dna探針circle?2均可與dna探針probe?b和至少一dna探針probe?a互補配對；
8、(5)在步驟(4)所得的反應產物中加入dna連接酶進行成環連接；
9、(6)在步驟(5)所得的反應產物中加入dna聚合酶和dntps進行滾環擴增反應；
10、(7)在步驟(6)所得的反應產物中加入成像檢測探針，進行原位雜交，然后進行成像檢測。
11、在本專利技術的一個優選實施方案中，所述dna探針probe?a的5’端具有長度為18nt的第一特異性編碼序列nnnntgagttgagtnnnn(seq?id?no.54)，其中，nn＝ag、ga或tc，所述dna探針probe?a的3’端具有長度為20nt的與目標基因的mrna互補配對的序列。
12、進一步優選的，所述環狀dna探針circle?1的5’端具有長度為18nt的第二特異性編碼序列nnnnactcaactcannnn(seq?id?no.55)，其中，nn＝ag、ga或tc，該第二特異性編碼序列與對應的所述第一特異性編碼序列互補配對。
13、更進一步優選的，所述能夠與5-乙炔基尿苷發生共價結合的修飾基團為疊氮基團。
14、更進一步優選的，所述dna連接酶為t4?dna連接酶。
15、更進一步優選的，所述dna聚合酶為phi29?dna聚合酶。
16、更進一步優選的，所述能夠與5-乙炔基尿苷發生共價結合的修飾基團為疊氮基團；所述dna連接酶為t4?dna連接酶；所述dna聚合酶為phi29?dna聚合酶。
17、本專利技術的有益效果是：
18、1、本專利技術旨在解決單細胞轉錄組分析中的挑戰，特別是在保留新合成rna的空間信息、提高檢測效率和靈敏度方面的難題，基于代謝標記、鄰位滾環擴增技術(pla-rca)和原位熒光測序技術，能夠從時間和空間兩個維度解析單細胞動態變化信息，進而揭示疾病發生、細胞分化及功能響應之間的關系。
19、2、如圖1所示，本專利技術首先利用代謝標記技術對細胞在特定時間內新生成的rna進行特異性標記，以確保能夠精確識別和追蹤新合成的rna分子；隨后，通過鄰位滾環擴增技術(pla-rca)實現新生rna靶標的原位特異性信號放大，從而提高新生rna的檢測效率和準確度；最后，利用原位熒光測序技術實現對新本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.如權利要求1所述的一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：所述DNA探針Probe?A的5’端具有長度為18nt的第一特異性編碼序列NNNNTGAGTTGAGTNNNN，其中，NN＝AG、GA或TC，所述DNA探針Probe?A的3’端具有長度為20nt的與目標基因的mRNA互補配對的序列。
3.如權利要求2所述的一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：所述環狀DNA探針Circle?1的5’端具有長度為18nt的第二特異性編碼序列NNNNACTCAACTCANNNN，其中，NN＝AG、GA或TC，該第二特異性編碼序列與對應的所述第一特異性編碼序列互補配對。
4.如權利要求1至3中任一權利要求所述的一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：所述能夠與5-乙炔基尿苷發生共價結合的修飾基團為疊氮基團。
5.如權利要求1至3中任一權利要求所述的一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：所述DNA連接酶為T4?DNA連接酶。
6.如權利要求
7.如權利要求1至3中任一權利要求所述的一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：所述能夠與5-乙炔基尿苷發生共價結合的修飾基團為疊氮基團；所述DNA連接酶為T4?DNA連接酶；所述DNA聚合酶為phi29?DNA聚合酶。
...【技術特征摘要】
1.一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.如權利要求1所述的一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：所述dna探針probe?a的5’端具有長度為18nt的第一特異性編碼序列nnnntgagttgagtnnnn，其中，nn＝ag、ga或tc，所述dna探針probe?a的3’端具有長度為20nt的與目標基因的mrna互補配對的序列。
3.如權利要求2所述的一種時空分辨單細胞轉錄組檢測方法，其特征在于：所述環狀dna探針circle?1的5’端具有長度為18nt的第二特異性編碼序列nnnnactcaactcannnn，其中，nn＝ag、ga或tc，該第二特異性編碼序列與對應的所述第一特異性編碼序列互補配對。
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