【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體而言，涉及一種適用于單細胞測序的核酸適配體組合及其在膽道癌細胞圖譜構建中的應用。
技術介紹
1、膽道癌是僅次于肝細胞癌的第二大原發肝臟惡性腫瘤，包括膽管癌和膽囊癌。膽道癌具有高侵襲性，早期臨床表現隱匿，病情進展迅速，手術切除通常不能取得滿意的治療效果，對放療和化療均不敏感，導致患者預后極差，并且大多數患者在診斷時就已發展成晚期、不可切除的疾病。目前圍繞膽道癌的細胞圖譜雖取得一定進展，但仍面臨著樣本獲取困難、腫瘤異質性、免疫微環境研究不足、技術限制、數據整合和分析挑戰以及免疫治療反應異質性等缺陷。亟需通過技術創新發展新的膽道癌細胞圖譜構建技術。
2、單細胞高通量測序從單個細胞水平上獲取樣本信息，解決了傳統測序技術基于群體細胞測序而掩蓋細胞間異質性的難題，把研究精度從群體細胞精確到單個細胞，有助于深入探索細胞的異質性和生命活動。其中，單細胞轉錄組測序(scrna-seq)是當前應用最廣泛的單細胞測序技術，它可對單個細胞的mrna進行反轉錄、擴增和高通量測序，根據轉錄譜的相似性，可以分辨不同的細胞類型，甚至揭示新的細胞類型。其中，細胞圖譜構建是scrna-seq技術發展的重要應用，是研究基礎生物學、衰老、疾病、治療反應的基本前提。從市場上來看，隨著單細胞測序需求的日益增加，國際上許多測序公司相繼推出新一代的單細胞測序技術，相關的研究成果也越來越多，單細胞測序技術正在成為基因序列研究的熱點。2015年以來，10×genomics、drop-seq、micro-well、split-seq等技術的出現，
3、然而，廣泛使用的scrna-seq技術難以捕獲一個組織或器官中所有的細胞和基因，獲得的數據無法提供完整的細胞信息。同時，測序深度和規模、生物噪聲和技術噪聲都將限制scrna-seq數據集的可挖掘性。此外，轉錄組只是眾多調控定義細胞類型和狀態以及最終功能的其中一個環節。隨著技術的發展和進步，越來越多的組學技術被應用在精準醫學領域，如轉錄組，蛋白組，代謝組，微生物組，脂質組，免疫組等可以對單個細胞進行多組學分析，從分子層面定義個體的健康。同時，精準醫學領域中的挑戰之一也包括了平行檢測基因組、表觀組、轉錄組和蛋白質組中的細胞間異質性。將這些檢測結果聯系起來，有可能揭示健康發育和疾病中細胞行為的調控和功能機制。因此，整合分析多組學的單細胞測序數據能夠有效彌補單組學的局限，收集更完整的細胞類型和生物信息，助力生成全景細胞圖譜。對多組學的研究有助于加深對病理、藥理的理解，為生物醫藥企業進行藥物篩選和藥效評估打下了良好基礎。
4、單細胞多組學改變了復雜生物系統的研究，通過對數千個細胞中基因表達的常規測量，可以構建整個生物體的細胞圖譜。目前暫未有關于基于核酸適配體的單細胞高通量測序技術，建立較大規模的，將轉錄組、代謝組和微生物組數據與治療反應以及其他臨床數據相關聯，開發包括膽道癌免疫聯合治療療效多組學預測模型，并通過體內外模型對鑒定到的關鍵靶點進行機制解析的研究。
5、鑒于此，特提出本專利技術。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種適用于單細胞高通量測序的核酸適配體組合，利用該核酸適配體組合能夠特異性識別多個細胞膜表面的分子靶標，從而構建基于核酸適配體識別的單細胞圖譜。此外，在復雜的臨床血液樣本中，以膽道癌患者的外周血單個核細胞(pbmc)為模型，該核酸適配體組合能實現高特異性識別血液中細胞的多個生物標志物，有望為臨床中復雜血液樣本的分子分型提供研究思路，以及基于外周血的伴隨診斷提供依據。
2、本專利技術采用的技術方案具體如下：
3、第一方面，本專利技術提供了一種適用于單細胞高通量測序的核酸適配體組合，其核心序列包括如seq?id?no.1～seq?id?no.291所示的核苷酸序列。
4、核酸適配體是一段長為15-60nt左右的寡核苷酸序列，具有靶標范圍廣、親和力高、特異性強、容易合成等一系列優點，且可精確識別金屬離子、小分子、氨基酸、多肽、蛋白和細胞，被譽為“化學家的抗體”。作為一類識別分子，核酸適配體應用于分子醫學能識別疾病標志物、辨認病變細胞，適合于臨床應用的分子探針和治療藥物。
5、相比于抗體，核酸適配體具有以下特點：(1)核酸適配體是核酸序列，可以直接化學合成pcr引物和捕獲序列用于匹配單細胞測序平臺，抗體需要化學偶聯dna序列；(2)抗體-dna序列的制備比例不可控，效率不均勻；(3)核酸適配體成本低，抗體以及偶聯成本較高；(4)核酸適配體分子量小，幾乎無位阻效應，抗體分子量較大，有位阻效應；(5)有些膜蛋白較難純化，無法制備相應抗體，比較容易篩選核酸適配體；(6)針對特異樣本篩選獲得的核酸適配體富集文庫，在疾病診療領域具有廣闊的應用前景。
6、本專利技術利用對結合在細胞膜表面的核酸適配體進行單細胞高通量測序，擬建立靶標數量超過290個的，將轉錄組、代謝組和微生物組數據與治療反應以及其他臨床數據相關聯的技術，實現細胞圖譜的構建。在本實驗室已申請專利cn117552114a的基礎上，擴大靶點檢測的覆蓋范圍，提供了一種數百條規模級別的核酸適配體組合，上述核酸適配體組合的核心序列包括seq?id?no.1～seq?id?no.291所示的核苷酸序列，各核酸適配體對其靶標具有高特異性親和合力，利用上述核酸適配體能夠構建出臨床血液細胞圖譜。
7、對于上述核酸適配體組合的設計，其難點在于不僅要求每條序列對其靶標有較高的特異性識別能力，還需要克服數百條規模級別中分子間相互干擾的問題，為此專利技術人優選了上述核酸適配體進行組合，其中各條核酸適配體對應的檢測靶點如下：
8、
9、
10、
11、
12、
13、
14、在一些實施例中，核酸適配體組合還包括將seq?id?no.1～seq?id?no.291所示的核苷酸序列經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與seq?id?no.1～seq?idno.291具有80％以上同一性的單鏈dna或其衍生物。
15、在一些實施例中，核酸適配體組合中的每條核酸適配體的結構為：5’接頭序列-核心序列-3’接頭序列，核心序列為seq?id?no.1～seq?id?no.291所示的核苷酸序列。
16、在一些實施例中，5’接頭序列如seq?id?no.292所示：ttgtcttcctaagaccgcttggcctccgacttaaa；3’接頭序列為如seq?id?no.293所示：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。
17、對于接頭序列，本專利技術為了適配華大高通量測序平臺，選擇了上述接頭序列，但是需要說明的是，本專利技術所包括的接頭序列并不限于上述序列，還包括適配其他平臺的接頭序列，本領域技術人員可根據不本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種適用于單細胞高通量測序的核酸適配體組合，其特征在于，所述核酸適配體組合包括如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.291所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的核酸適配體組合，其特征在于，所述核酸適配體組合還包括將SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.291所示的核苷酸序列經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.291具有80％以上同一性的單鏈DNA或其衍生物。
3.根據權利要求2所述的核酸適配體組合，其特征在于，所述核酸適配體組合中的每條核酸適配體的結構為：5’接頭序列-核心序列-3’接頭序列，所述核心序列為SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.291所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的核酸適配體組合，其特征在于，所述5’接頭序列如SEQ?IDNO.292所示；所述3’接頭序列為如SEQ?ID?NO.293所示。
5.根據權利要求1-4任一項所述的核酸適配體組合，其特征在于，所述核酸適配體組合的靶點包括：3T3-L1?adipocyte、e...
【技術特征摘要】
1.一種適用于單細胞高通量測序的核酸適配體組合，其特征在于，所述核酸適配體組合包括如seq?id?no.1～seq?id?no.291所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的核酸適配體組合，其特征在于，所述核酸適配體組合還包括將seq?id?no.1～seq?id?no.291所示的核苷酸序列經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與seq?id?no.1～seq?id?no.291具有80％以上同一性的單鏈dna或其衍生物。
3.根據權利要求2所述的核酸適配體組合，其特征在于，所述核酸適配體組合中的每條核酸適配體的結構為：5’接頭序列-核心序列-3’接頭序列，所述核心序列為seq?id?no.1～seq?id?no.291所示的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的核酸適配體組合，其特征在于，所述5’接頭序列如seq?idno.292所示；所述3’接頭序列為如seq?id?no.293所示。
5.根據權利要求1-4任一項所述的核酸適配體組合，其特征在于，所述核酸適配體組合的靶點包括：3t3-l1?adipocyte、emodin、mature3t3-l1?adipocytes、ctla-4、h37rv、pcnaand?ki13b、cd8、annexin?a2、cd44、e.coli?11775、type?11of?streptococcus?pyogenes、axl?tyrosine?kinase?receptor、glioblastoma?multiforme、omvs?of?multiple?gram-negative?bacteria、integrinα6β4、murine?c-kit?receptor、siglec-5protein、listeriamonocytogenes?atcc19115、pneumoniae、yersinia?enterocolitica、cd20、virus-encodedhemagglutinin、pl45、cd109、staphylococcus?epidermidis、endothelium-and?platelet-selectins、bone?marrow?mesenchymal?stem?cells、migm、hepatocellular?carcinoma、mouse?liver?hepatoma?cell?line?bnl?1me?a.7r.1cells、stress-inducedphosphoprotein?1、v.fischeri、ige、cd71、pd-l1、proprotein?convertase?subtilisin/kexin?9、integrinβ1、mr/dc-sign?peptide、galectin-7、cd63?protein、human?cd4protein、cd73、cd117、cd133、cd33、cd70、cd19、cd-31and?actin、cd25、h9n2?aiv?purifiedhaemagglutinin、human?crp、myoglobin、h2a?protein、bacterial?rna?polymerase、malarial?antigen?pfldh、ybx1、sars-cov-2rbd、vimentin、zika?ns1、ctni、sephadex、g-protein-coupled?cholecystokinin?b?receptor、hepatitis?b?surface?antigen、tgf-βreceptorii、epithelial?cell?adhesion?molecule、transcription?factor?protein?ap-1、sepiapterin、anti-hil-17a、gremlin-1、human?lipocalin?6、rhesus?d、mas-relatedg-protein?coupled?receptor?x2、aspartyl?proteases?b-site?app-cleaving?enzyme1、mup13、integrinβ3、connective?tissue?growth?factor、non-structural?protein?1、ecombinant?influenza?a?mini-hemagglutinin?protein、carcinoembryonic?antigen、intercellular?adhesion?molecule-1，cd54、ca2+binding?protein?s100p、hspx、ole?e?1、covid-19nucleocapsid?protein、ras?protein、α4integrin、lipl32、β-lactoglobulin、β-conglutin、angiotensin?ii?peptide、kallikrein-related?peptidase?6、fc?region?ofmouse?igg、protective?antigen?63、h9?peptide、transcription?factor?doublehomeobox?protein?4、protein?domain?iii、igfiir、orai1、scd80、cε3-cε4protein、alkaline?phosphatase(ap)heterodimers、recombinant?human?erythropoietin-α、humanrad51、hcv?rna?polymerase、taq?dna?polymerase、neuropeptide?y、thrombin、abf1protein、rat?liver?x?receptors、hiv-rt、platelet-derived?growth?factor、globo?h、hpv、proneurotensin/neuromedin?n、anti-flag?m2?antibody、a-synucleinoligomers、a-bungarotoxin、antigen?binding?fragment?of?antivesicular?stomatitis?virusrabbit?polyclonal?antibodies、cd8a、ca125、thymidine?kinase?1、nucleolin、aflatoxin?b1、amplified?in?breast?cancer?1、prostate?specific?membrane?antigen、alpha-fetoprotein、golgi?protein?73、beta1-adrenoceptor?autoantibodies、phospholamban、dc-specific?intercellular...
【專利技術屬性】
技術研發人員：譚蔚泓，彭瑞資，韓達，楊允奔，杜紫艷，
申請(專利權)人：中國科學院杭州醫學研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。