【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于病毒載體檢測，涉及一種對細胞進行病毒載體轉導的感染性測算方法。
技術介紹
1、病毒感染性是病毒進入細胞并建立感染的能力，經(jīng)典的病毒感染性測試和評估方法是對病毒感染性滴度的測定。本專利技術所述病毒載體為一種特殊的病毒，該特殊病毒經(jīng)過分子生物學改造后失去了自我復制的能力，但保留了感染宿主細胞和在宿主細胞中穩(wěn)定表達轉導進入的外源基因的能力，常被應用于病毒感染機制的研究、疫苗制備、轉基因細胞制備、基因治療和藥物靶向運輸?shù)惹把嘏R床醫(yī)學的應用。由于病毒感染過程的復雜性，直到目前，對包括病毒載體在內的病毒的感染性評估仍然缺乏準確有效的方法，這對病毒相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成極大阻礙。我們利用病毒載體作為研究病毒感染性的模型，實現(xiàn)了對病毒感染性的認知和測算更為全面而深刻的發(fā)現(xiàn)。
2、本專利技術的感染性測算涉及的相關參數(shù)包括感染效率、感染復數(shù)、感染性常數(shù)和感染性滴度（在病毒載體的應用中，感染效率一般稱為轉導效率）。其中感染效率（infectionefficiency，轉導效率，transduction?efficiency）是被病毒感染的細胞數(shù)量和總細胞數(shù)量的比值，一般在0-100%的范圍內；感染復數(shù)（multiplicity?of?infection，簡稱moi）是在一個系統(tǒng)中能夠感染細胞的病毒數(shù)和總細胞數(shù)之比。；感染性常數(shù)是特定病毒樣品中平均病毒活力的表征參數(shù)，具體表征的是病毒進入細胞并完成感染的能力，由2倍的moi與感染完成時間的平方的比值計算得到；感染性滴度是病毒樣品中所含可感染細胞的病毒顆粒數(shù)量，常用單位為tu/ml。
3、在病毒載體的應用中，通過轉導效率計算感染復數(shù)，可應用于病毒載體的感染性滴度檢測；反過來，通過感染復數(shù)計算轉導效率，可在基因治療、藥物靶向運輸?shù)葢弥袑Σ《据d體的使用劑量進行理論判斷。
4、傳統(tǒng)常用的病毒載體感染性測試方法包括tcid50測試法、噬斑測試法、qpcr測試法、流式細胞測試法。
5、tcid50測試法，基于終點稀釋原理，對可導致半數(shù)待感染物被成功感染的稀釋倍數(shù)進行測定；噬斑測試法，通過檢測病毒樣品接種到單層細胞培養(yǎng)物后形成的病毒噬斑數(shù)量對病毒樣品中可感染細胞的病毒數(shù)量的總數(shù)進行檢測。兩者因為存在包括通量低、操作復雜、主觀性誤差大等原因，難以廣泛應用。
6、qpcr測試法通過測定病毒載體基因組和宿主細胞基因組的拷貝數(shù)比值作為moi后，根據(jù)感染復數(shù)、稀釋倍數(shù)和初始細胞數(shù)三者的乘積計算感染性滴度。但是，并非所有進入細胞基因組的病毒基因組所攜帶的外源基因都可以成功表達，所以，qpcr測試法無法準確測定病毒載體有效的感染性滴度。
7、流式細胞測試法通過標記病毒載體轉導后細胞表達的外源蛋白，實現(xiàn)對轉導成功的細胞占總細胞數(shù)的比例的檢測，以此作為moi后，根據(jù)感染復數(shù)、稀釋倍數(shù)和初始細胞數(shù)三者的乘積計算感染性滴度。但是，一個細胞可以感染多個病毒載體，因此，流式細胞測試法也無法準確測定病毒載體的感染性滴度。在感染性滴度無法準確測定的情況下，也就無法對細胞轉導效率進行預測。
8、因此，在基因治療相關的轉基因細胞制備中，為了盡可能得到更高的轉導效率，只能加入盡可能多的病毒載體。而由于對插入突變致癌的擔憂，又不得不限制加入病毒載體的量。因此，準確預測病毒載體的轉導效率十分重要。
9、以上表明對病毒，尤其是病毒載體的感染性測試仍然缺乏一種準確而全面的方法。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術的目的是提供一種結合感染性滴度和感染性常數(shù)的病毒載體感染性測算方法，以能夠準確而全面的進行病毒載體的感染性相關參數(shù)的測算。
2、為實現(xiàn)此目的，在基礎的實施方案中，本專利技術提供一種結合感染性滴度和感染性常數(shù)的病毒載體感染性測算方法，所述的測算方法包括如下步驟：
3、（11）細胞培養(yǎng)和計數(shù)：在細胞培養(yǎng)板每孔中加入相同數(shù)量的細胞，在相同體積的同種培養(yǎng)基條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時后，在進行病毒載體轉導前測定其中多孔中的細胞數(shù)，并由此計算確定各孔中細胞數(shù)的平均值n，單位為個/孔，作為轉導實驗的初始細胞數(shù)；
4、（12）病毒載體稀釋樣品制備：取病毒載體樣品用所述的培養(yǎng)基稀釋d倍后，分別取v1體積和v2體積，分別用所述的培養(yǎng)基補足至同樣的體積v0，分別得到第一病毒載體稀釋樣品和第二病毒載體稀釋樣品，且v2=4v1，v1和v2的單位均為μl；
5、（13）細胞轉導：去除步驟（11）所得細胞培養(yǎng)板的每孔中所述的培養(yǎng)基，然后在不同孔中分別加入體積的所述的第一病毒載體稀釋樣品和所述的第二病毒載體稀釋樣品，進行細胞轉導的培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時間；
6、（14）轉導效率測定：采用合適的方法分別測定所述的第一病毒載體稀釋樣品對細胞的轉導效率和所述的第二病毒載體稀釋樣品對細胞的轉導效率；
7、（15）轉導完成時間計算：利用如下公式（i）計算所述的第一病毒載體稀釋樣品對細胞的轉導的完成時間：
8、????????????（i）
9、（16）感染復數(shù)計算：利用公式（i）計算得到的t1和如下公式（ii）計算所述的第一病毒載體稀釋樣品對細胞的感染復數(shù)，所述的第二病毒載體稀釋樣品對細胞的感染復數(shù)，
10、??????????????????????（ii）
11、（17）感染性常數(shù)計算：利用如下公式（iii）計算所述的第一病毒載體稀釋樣品和所述的第二病毒載體稀釋樣品對細胞的相同的感染性常數(shù)i，
12、????????????????????????（iii）
13、（18）感染性滴度計算：利用如下公式（iv）計算病毒載體樣品的感染性滴度t，單位為tu/ml，
14、????????????????????（iv）
15、（19）任意病毒載體接種體積的轉導效率預測：設為從步驟（12）中稀釋d倍的病毒載體溶液中取出的任意小于或等于v0的病毒載體溶液體積，用所述的培養(yǎng)基補足至體積v0，得到第三病毒載體稀釋樣品，且的單位為μl，設檢測到的初始細胞數(shù)為nk，使用體積第三病毒載體稀釋樣品進行同步驟（13）的病毒轉導實驗，設mk和rk為第三病毒載體稀釋樣品對細胞進行轉導的感染復數(shù)和轉導效率，分別利用如下公式（v）和公式（vi）計算可得到所述的第三病毒載體稀釋樣品對細胞的感染復數(shù)mk和轉導效率rk，
16、??????????????????????（v）
17、?????????（vi）。
18、上述病毒載體的感染性測算方法簡稱為四倍濃度測試法（quadruple?concentrationdetection?method,?qcdm）。
19、在一種優(yōu)選的實施方案中，本專利技術提供一種結合感染性滴度和感染性常數(shù)的病毒載體感染性測算方法，其中步驟（14）中，測定所述的第一病毒載體稀釋樣品對細胞的轉導效率和/或所述的第二病毒載體稀釋本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種結合感染性滴度和感染性常數(shù)的病毒載體感染性測算方法，其特征在于，所述的測算方法包括如下步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述的測算方法，其特征在于：步驟（14）中，測定所述的第一病毒載體稀釋樣品對細胞的轉導效率和/或所述的第二病毒載體稀釋樣品對細胞的轉導效率采用的是流式細胞儀檢測法、熒光細胞計數(shù)儀檢測法、qPCR檢測法或原位免疫熒光測試法。
3.根據(jù)權利要求1所述的測算方法，其特征在于：所述的第一病毒載體稀釋樣品、所述的第二病毒載體稀釋樣品、所述的第三病毒載體稀釋樣品由同一病毒載體樣品或于相同保存條件的同一批次病毒載體樣品按照步驟（12）和/或步驟（19）進行配制得到，然后在相同培養(yǎng)條件對細胞轉導。
4.根據(jù)權利要求1所述的測算方法，其特征在于：步驟（13）中所述的培養(yǎng)一段時間，具體為培養(yǎng)24-120小時。
5.根據(jù)權利要求1-3之一所述的測算方法，其特征在于：所述的細胞選自HEK293T、HEK293、Jurkat或Vero細胞。
6.根據(jù)權利要求1-3之一所述的測算方法，其特征在于：所述的病毒載體樣品選自慢病毒載體、
7.根據(jù)權利要求1-3之一所述的測算方法，其特征在于：所述的培養(yǎng)基可以是DMEM培養(yǎng)基，RPMI1640培養(yǎng)或其他培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中胎牛血清的含量為（0.5-20）%（v/v)，青霉素/鏈霉素抗體溶液含量為1%（v/v)。
8.根據(jù)權利要求1-3之一所述的測算方法，其特征在于：步驟（11）中，細胞培養(yǎng)板每孔中加入的細胞數(shù)量為1×104~1×106個。
9.根據(jù)權利要求1-3之一所述的測算方法，其特征在于：步驟（12）中，?D=1-1000。
10.根據(jù)權利要求1-3之一所述的測算方法，其特征在于：步驟（12）中，V0=50-1000μl。
...【技術特征摘要】
1.一種結合感染性滴度和感染性常數(shù)的病毒載體感染性測算方法，其特征在于，所述的測算方法包括如下步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述的測算方法，其特征在于：步驟（14）中，測定所述的第一病毒載體稀釋樣品對細胞的轉導效率和/或所述的第二病毒載體稀釋樣品對細胞的轉導效率采用的是流式細胞儀檢測法、熒光細胞計數(shù)儀檢測法、qpcr檢測法或原位免疫熒光測試法。
3.根據(jù)權利要求1所述的測算方法，其特征在于：所述的第一病毒載體稀釋樣品、所述的第二病毒載體稀釋樣品、所述的第三病毒載體稀釋樣品由同一病毒載體樣品或于相同保存條件的同一批次病毒載體樣品按照步驟（12）和/或步驟（19）進行配制得到，然后在相同培養(yǎng)條件對細胞轉導。
4.根據(jù)權利要求1所述的測算方法，其特征在于：步驟（13）中所述的培養(yǎng)一段時間，具體為培養(yǎng)24-120小時。
5.根據(jù)權利要求1-3之一所述的測算方法，其特征在...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：黃文鋒，傅博強，張玲，
申請(專利權)人：中國計量科學研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。