【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種高產(chǎn)核苷菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、核苷是一類糖苷的總稱。核苷是核酸和核苷酸的組成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脫氧核糖與嘧啶堿或嘌呤堿縮合而成。核苷一般為無色結(jié)晶，不溶于普通有機(jī)溶劑，易溶于熱水，熔點(diǎn)為160～240℃。由d-核糖生成的核苷稱核糖核苷，參與rna組成，由d-α-脫氧核糖生成的核苷稱脫氧核糖核苷，參與dna組成。d-核糖與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶縮合生成相應(yīng)的腺嘌呤核糖核苷、鳥嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它們分別簡稱為腺苷(a)、鳥苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。
2、鳥嘌呤核苷(鳥苷)和次黃嘌呤核苷(肌苷)在食品和醫(yī)藥行業(yè)有著廣泛的作用。在食品領(lǐng)域，鳥苷和肌苷分別是鳥苷酸二鈉和肌苷酸二鈉的重要前體，而鳥苷酸二鈉與肌苷酸二鈉組合使用作為食品增鮮劑，廣泛應(yīng)用于雞精、醬油等調(diào)味品中。在醫(yī)藥領(lǐng)域，鳥苷和肌苷可以作為多種抗病毒藥物的醫(yī)藥中間體，如無環(huán)鳥苷、三氮唑核苷、三磷酸鳥苷鈉等都需要鳥苷作為合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前體，而肌苷酸可以作為合成腺苷酸(amp)和鳥苷酸(gmp)的前體，適用于各種原因引起的白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥、各種心臟疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外還可治療中心視網(wǎng)膜炎、視神經(jīng)萎縮等。
3、腺苷即腺嘌呤核苷，化學(xué)名為6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氫嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脫磷酸后的產(chǎn)物，屬于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一種遍布人
4、目前，微生物發(fā)酵是生產(chǎn)核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或短小芽孢桿菌等。在生長菌株的選育與改造過程中，通過使用紫外誘變、硫酸二乙酯誘變育種，定向選育核苷高產(chǎn)菌株；或者根據(jù)細(xì)菌中核苷酸的代謝路徑和調(diào)節(jié)機(jī)理，深入了解菌株遺傳背景及菌株特性，通過代謝工程手段，有目的性地對菌株進(jìn)行改造，以獲得性狀優(yōu)良、能夠高產(chǎn)核苷的生產(chǎn)菌株。但目前核苷菌種的發(fā)酵性能仍較差、核苷的轉(zhuǎn)化率仍較低，不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是提供一種高產(chǎn)核苷菌株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
2、為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，第一方面，本專利技術(shù)提供一種修飾的微生物，所述微生物相比于未修飾的微生物，其轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強(qiáng)的核苷生產(chǎn)能力。
3、本專利技術(shù)中，所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn在ncbi上的參考序列編號為np_390403.1。
4、進(jìn)一步地，微生物中的轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的活性降低或喪失是由選自以下1)-3)，或任選的組合實(shí)現(xiàn)的：
5、1)通過改變所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的氨基酸序列而降低或喪失；
6、2)通過改變編碼所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的核苷酸序列而降低或喪失；
7、3)通過敲除所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼序列而喪失。
8、進(jìn)一步地，采用誘變、定點(diǎn)突變或同源重組的方法來降低所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼基因的表達(dá)或敲除所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼基因。
9、在本專利技術(shù)的具體實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn活性降低或喪失是通過如下方式實(shí)現(xiàn)的：轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼基因的起始密碼子由gtg突變?yōu)閠tg。
10、所述微生物可以是枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(bacillus?pumilus)或大腸桿菌(escherichia?coli)等。例如，出發(fā)菌株為b.subtilis?168、b.subtilis?a5(菌株b.subtilis?a5構(gòu)建方法參見cn110257315b)、b.a?836(參見cn112574934a)。
11、第二方面，本專利技術(shù)提供生產(chǎn)核苷菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，失活或弱化微生物中的轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼基因。
12、所述弱化選自以下a)-c)，或任選的組合實(shí)現(xiàn)的：
13、a)通過改變所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的氨基酸序列而降低或喪失；
14、b)通過改變編碼所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的核苷酸序列而降低或喪失；
15、c)通過敲除所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼序列而喪失。
16、弱化的方法可選自誘變、定點(diǎn)突變、同源重組等中的至少一種。
17、優(yōu)選地，弱化是通過如下方式實(shí)現(xiàn)的：轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼基因的起始密碼子由gtg突變?yōu)閠tg。
18、第三方面，本專利技術(shù)提供按照所述方法構(gòu)建得到的重組菌。
19、第四方面，本專利技術(shù)提供所述微生物或按照所述方法構(gòu)建得到的重組菌在核苷或核苷衍生物發(fā)酵生產(chǎn)或提高核苷或核苷衍生物發(fā)酵產(chǎn)量中的應(yīng)用。
20、本專利技術(shù)所述核苷衍生物包括但不限于：
21、①腺苷，及腺苷相關(guān)衍生物，如三磷酸腺苷(atp)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷等；
22、②肌苷，及肌苷相關(guān)衍生物，如肌苷酸、鳥苷酸、腺苷酸等；
23、③鳥苷，及鳥苷相關(guān)衍生物，如鳥嘌呤、鳥苷酸、核黃素、二乙酰鳥苷酸等。
24、第五方面，本專利技術(shù)提供一種生產(chǎn)核苷的方法，所述方法包括如下步驟：
25、i)培養(yǎng)所述微生物或按照所述方法構(gòu)建得到的重組菌，獲得培養(yǎng)物；
26、ii)從步驟i)中獲得的所述培養(yǎng)物中收集所產(chǎn)生的核苷。
27、借由上述技術(shù)方案，本專利技術(shù)至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
28、本專利技術(shù)提供一種枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌，其細(xì)胞內(nèi)編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的基因發(fā)生起始密碼子弱化gtg→ttg(或其他方式使得ccpn編碼的蛋白質(zhì)較野生型相比活性降低)或基因片段缺失(或其他方式使得ccpn編碼的蛋白質(zhì)沒有活性)，使得所述菌株產(chǎn)生核苷的能力與未修飾的菌株相比增強(qiáng)。
29、突變菌株b.subtilis?a0057(ccpng1t菌株)和b.subtilis?a0059(△ccpn菌株)，較出發(fā)菌b.subtilis?168相比，腺苷產(chǎn)量分別由5.1g/l提高至5.9g/l、6.2g/l，肌苷產(chǎn)量由0.8g/l分別提高至1.1g/l、1.4g/l；突變菌株b.subtilis?a0058(ccpng1t菌株)和b.subtilis?a0060(△ccpn菌株)，較出發(fā)菌b.subtilis?a5相比，腺苷產(chǎn)量分別由7.9g/l提高至8.5g/l、9.0g/l，肌苷產(chǎn)量由1本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種修飾的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修飾的微生物，其轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpN的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強(qiáng)的核苷生產(chǎn)能力；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于，微生物中的轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpN的活性降低或喪失是由選自以下1)-3)，或任選的組合實(shí)現(xiàn)的：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物，其特征在于，采用誘變、定點(diǎn)突變或同源重組的方法來降低所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpN的編碼基因的表達(dá)或敲除所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpN的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于，轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpN活性降低或喪失是通過如下方式實(shí)現(xiàn)的：轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpN的編碼基因的起始密碼子由gtg突變?yōu)閠tg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的微生物，其特征在于，所述微生物為枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacillus?pumilus)或大腸桿菌(Escherichia?coli)。
6.生產(chǎn)核苷
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，弱化的方法選自誘變、定點(diǎn)突變、同源重組中的至少一種；
8.按照權(quán)利要求6或7所述方法構(gòu)建得到的重組菌。
9.權(quán)利要求1-5任一項所述微生物或權(quán)利要求8所述重組菌在核苷或核苷衍生物發(fā)酵生產(chǎn)或提高核苷或核苷衍生物發(fā)酵產(chǎn)量中的應(yīng)用；
10.一種生產(chǎn)核苷的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種修飾的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修飾的微生物，其轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的活性降低或喪失，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強(qiáng)的核苷生產(chǎn)能力；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于，微生物中的轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的活性降低或喪失是由選自以下1)-3)，或任選的組合實(shí)現(xiàn)的：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物，其特征在于，采用誘變、定點(diǎn)突變或同源重組的方法來降低所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼基因的表達(dá)或敲除所述轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其特征在于，轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn活性降低或喪失是通過如下方式實(shí)現(xiàn)的：轉(zhuǎn)錄抑制因子ccpn的編碼基因的起始密碼子由gtg突變?yōu)閠tg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的微生物，其特征在于，所述微生...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張孟娟，吳濤，王靖蓉，薛婷莉，劉燦彬，呂言，趙津津，李巖，
申請(專利權(quán))人：廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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