【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種海產品中五氯酚檢測方法，尤其是涉及一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法。
技術介紹
1、五氯苯酚(pcp)及其可溶性五氯苯酚鈉鹽(napcp)近幾十年來作為除草劑、滅螺劑、木材防腐劑、殺菌劑和殺菌劑的活性成分進行商業生產及其釋放在環境中，對生態系統具有毒性作用。pcp及其鈉鹽在中國被大量用于消滅稻田、池塘內寄生血吸蟲的宿主釘螺，因其具有相對較高的疏水性、環境持久性和在水中較長的半衰期，五氯酚可通過食物鏈在生物體中蓄積，不易被生物降解。此外五氯酚有著較高蒸汽壓，容易從處理過木材表面上蒸發，從而導致人類吸入，急性吸入過多pcp可導致循環系統性影響甚至伴隨心力衰竭死亡，對人類生命產生嚴重威脅。五氯酚被國際癌癥研究機構(iarc)規定為可能致癌物(2b級)。
2、pcp通過廢水和河流輸入進入海洋，目前在藻類、環節動物、軟體動物、甲殼動物等海洋動植物以及沉積物中也均有不同程度的檢出。近年來，海產品中五氯酚含量一直是水產安全監測的重要對象，因而有必要對海產品中的五氯酚進行檢測。目前，五氯酚及其鈉鹽的檢測方法主要有氣相色譜法(gc)、液相色譜法(lc)或氣相色譜-質譜聯用法(gc-ms)。其中，gc和gc-ms需要對樣品進行衍生化處理，操作相對繁瑣；lc定性較差，且靈敏度不高。對于動物源性食品中pcp的樣品前處理手段主要采用液液萃取法和固相萃取法，但以上方法操作繁瑣，試劑使用量大。
技術實現思路
1、本專利技術是為了解決現有技術的五氯苯酚檢測方法存在的上述問
2、為了實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案：本專利技術的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，包括以下步驟：
3、(1)制樣
4、取海產品的可食用部分，均質后稱取2.0±0.02g樣品于50ml的離心管中。海產品為魚類時，可食用部分為脊背肌肉部分；海產品為蝦、貝和蟹類時，可食用部分為肌肉組織；均質后可-18℃冷凍保存。
5、(2)提取
6、在離心管中加入100μl的100μg/l的五氯酚-13c6同位素內標工作液，加入2.0g無水硫酸鎂和10ml1％乙酸乙腈溶液，漩渦振蕩提取后，超聲波提取，離心取上清液，殘渣中用1％乙酸乙腈溶液重復提取1次，合并提取液于旋轉蒸發瓶中，旋轉蒸發至干后，加入2ml的75％乙腈水溶液，旋渦復溶，得復溶液，待凈化。本專利技術中采用同位素稀釋內標法定量，以改善樣品回收率偏低的問題；由于樣品中含有部分水分，加入無水硫酸鎂吸附水分，以此來增加提取劑的提取效率，同時樣品中的pcp部分以結合態形式存在，因此本專利技術在對提取后的溶液進一步的采用超聲輔助酸解，以增加提取劑的萃取效率；專利技術人通過試驗發現，乙腈良好的沉淀蛋白效果使得提取液中主要的干擾物質為脂類等弱極性化合物，加入1％冰醋酸，能讓酸化后的乙腈更為清澈干凈，因此，本專利技術中最終確定1％酸化乙腈為本專利技術的最佳提取劑，10ml為最佳提取量。
7、(3)凈化
8、移取全部復溶液過captiva?emr-lipid小柱，過濾并收集所有濾液，濾液過濾，得上機溶液。海產品含有大量的蛋白質和脂肪以及其他長鏈物質，這些物質可能被共同萃取出來，對檢測結果產生影響并可能會縮短儀器使用壽命。為更好研究五氯苯酚鈉的回收率，專利技術人采用4種類型p/n的captiva?emr-lipid、florisil?spe、si/psa、oasismax的固相萃取柱和cnwbond?psa分散固相萃取劑進行回收率的比較，發現captiva?emr-lipid回收率為93％，效果最佳，且captiva?emr-lipid萃取柱還具有無需活化，快速過濾的特點，同時節省了時間，提高了凈化效率，因此本專利技術中選擇captiva?emr-lipid小柱進行凈化。
9、(4)液相色譜串聯質譜檢測
10、用進樣針抽取上機溶液，按設定的色譜-質譜條件上樣，供uplc-ms/ms分析，將得到的五氯酚的峰面積代入標準工作曲線，計算得到五氯酚的濃度。
11、作為優選，步驟(2)中，漩渦振蕩提取5-7min；超聲波提取5-15min；6000-8000r/min離心5-7min；旋轉蒸發35-40℃。
12、作為優選，步驟(3)中，濾液用0.22μm有機濾膜過濾。
13、作為優選，步驟(4)中，色譜條件為：采用waters?acquity?uplc?beh?c18柱，柱規格100mm×2.1mm，1.7μm；儀器室內溫度：20℃；色譜柱溫度：40℃；流動相a為5mmol/l乙酸銨溶液，b為甲醇；梯度洗脫程序如下：初始40％b；0-6.5min，40％-100％b；6.5-9.0min，100％b-100％b；9.0-9.5min，100％b-40％b；9.5-12min，40％-40％b；進樣量：10μl；流速：0.2ml/min。pcp疏水性較強，大部分研究報道通常采用c18色譜柱作為分析柱，但是不同品牌的c18色譜柱由于在硅膠純度、鍵合和雜化技術等生產工藝存在區別，導致其保留性能和選擇性存在不同進而影響目標物在質譜分析中的靈敏度。專利技術人發現不同品牌的c18色譜柱對pcp的保留能力具有差異性，且pcp出峰時間越遲其質譜響應越強，專利技術人通過試驗發現watersacquity?uplc?beh?c18色譜柱分析pcp時保留能力最強，具有最高的質譜響應，故選擇waters?acquity?uplc?beh?c18柱；五氯酚是一種鹵代酚類物質，為酸性化合物，性質穩定，相比乙腈流動相體系，pcp在甲醇流動相體系中出峰時間更遲，質譜響應值更高，為有效提高目標化合物的峰形，防止峰漂移情況的出現，穩定出峰時間，在水相中加入緩沖鹽(乙酸銨)；電噴霧離子源(esi)在含乙酸銨的該流動相中具有較好的靈敏度，故最終確定甲醇為有機相，5mmol/l乙酸銨為水相。
14、作為優選，所述質譜條件為：多反應監測模式；毛細管電壓：2.5kv；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；錐孔氣流量：200l/h；脫溶劑氣流量：1000l/h。
15、作為優選，所述質譜條件為：多反應監測模式；毛細管電壓：2.5kv；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；錐孔氣流量：200l/h；脫溶劑氣流量：1000l/h。
16、作為優選，步驟(4)中，標準曲線通過以下方法得到：準確移取五氯酚標準溶液，用甲醇溶解稀釋成1mg/l的標準儲備液，分別用不同的空白基質稀釋成0.5、1、2、5、10、20ng/ml的基質匹配標準工作溶液，按步驟(4)的條件進行測定，以進樣質量濃度為x軸、響應值為y軸繪制標準工作曲線，外標法定量。
17、因此，本專利技術具有如下有益效果：采用uplc-ms/ms法檢測海產品中的pcp，優化了提取條件和captiva?emr-lipid小柱凈化條件，運用同位素稀釋內標法定量，顯本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，步驟（2）中，漩渦振蕩提取5-7min；超聲波提取5-15min；6000-8000r/min離心5-7min；旋轉蒸發35-40℃。
3.根據權利要求1所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，步驟（3）中，濾液用0.22μm有機濾膜過濾。
4.根據權利要求1所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，步驟（4）中，色譜條件為：采用Waters?Acquity?UPLC?BEHC?18柱，柱規格100mm×2.1mm，1.7μm；儀器室內溫度：20℃；色譜柱溫度：40℃；流動相A為5mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序如下：初始40%B；0-6.5min，40%-100%B；6.5-9.0min，100%B-100%B；9.0-9.5min，100%B-40%B；9.5-12min，40%-40%B；進樣量：10μL；流速：0.2mL
5.根據權利要求1所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，所述質譜條件為：多反應監測模式；毛細管電壓：2.5kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；錐孔氣流量：200L/h；脫溶劑氣流量：1000L/h。
6.根據權利要求4所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，所述質譜條件為：多反應監測模式；毛細管電壓：2.5kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；錐孔氣流量：200L/h；脫溶劑氣流量：1000L/h。
7.根據權利要求6所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，步驟（4）中，標準曲線通過以下方法得到：準確移取五氯酚標準溶液，用甲醇溶解稀釋成1mg/L的標準儲備液，分別用不同的空白基質稀釋成?0.5、1、2、5、10、20ng?/ml的基質匹配標準工作溶液，按步驟（4）的條件進行測定，以進樣質量濃度為x軸、響應值為y軸繪制標準工作曲線，外標法定量。
...【技術特征摘要】
1.一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，步驟（2）中，漩渦振蕩提取5-7min；超聲波提取5-15min；6000-8000r/min離心5-7min；旋轉蒸發35-40℃。
3.根據權利要求1所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，步驟（3）中，濾液用0.22μm有機濾膜過濾。
4.根據權利要求1所述的一種海產品中五氯酚的液相色譜串聯質譜檢測方法，其特征在于，步驟（4）中，色譜條件為：采用waters?acquity?uplc?behc?18柱，柱規格100mm×2.1mm，1.7μm；儀器室內溫度：20℃；色譜柱溫度：40℃；流動相a為5mmol/l乙酸銨溶液，b為甲醇；梯度洗脫程序如下：初始40%b；0-6.5min，40%-100%b；6.5-9.0min，100%b-100%b；9.0-9.5min，100%b-40%b；9.5-12min，40%-...
【專利技術屬性】
技術研發人員：方益，何鵬飛，胡紅美，曾軍杰，李佩佩，
申請(專利權)人：浙江省海洋水產研究所，
類型：發明
國別省市：
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