【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及妊娠性疾病早期預警診斷，更具體地，涉及一種子癇前期聯合診斷標志物。
技術介紹
1、子癇前期(preeclampsia，pe)或稱為先兆子癇，是全球最常見妊娠期合并癥之一，是妊娠期并發癥相關死亡的主要原因，世界衛生組織統計報道表明，子癇前期發病率占全部妊娠的3％～10％，全球14％的孕產婦死亡和10～25％的圍產兒死亡可直接歸因于子癇前期。此外，越來越多的研究發現，子癇前期不僅會導致不良妊娠結局，還會對母親和子代的長期健康帶來負面影響。目前臨床上還沒有有效的產前子癇前期治療方法：在子癇前期及相關并發癥嚴重情況下，臨床上只能通過終止妊娠、娩出胎盤來緩解病情。
2、已有證據表明，子癇前期早期和晚期病例的病理生理學和病因學復雜。早發型，即妊娠34周前發生的子癇前期，被認為主要是胎盤發育和功能缺陷所導致，而環境及母體源病因可能在晚發型子癇前期的發生中占主導地位(即妊娠34周后發生的子癇前期)。由于病因學和發病機制的復雜性，目前臨床實踐中還缺乏基于某個單一標志物即可實現高效的子癇前期預測。因此，多種及一系列生物標志物的綜合考量或加權聯合應用，包括生化、超聲和生理母體特征，及代謝物和異常表達基因，將在子癇前期發生的預測、臨床診斷等方面具有重要的應用價值。揭示和明確新的生物標志物用于子癇前期的篩查、診斷和監測，具有重要的科學價值及臨床意義。
3、目前已經揭示有近千種mirna在胎盤中表達，多個在胎盤表達的mirna與子癇前期的發生具有顯著相關。mirna因其提取和檢測便捷，表達廣泛，且在機體生理及病理發生過
4、人絨毛膜滋養層細胞(htr-8/svneo)異常增殖和分化、侵襲和遷移能力降低以及凋亡增加是與子癇前期高度相關的胎盤典型病理特征。因此，鑒定調節滋養層細胞分化、增殖、凋亡、侵襲和遷移的mirna，可以促進我們了解子癇前期調控的分子機制。
技術實現思路
1、本專利技術旨在克服上述現有技術至少一項的不足，提供一種子癇前期聯合診斷標志物，應用于子癇前期的檢測具有特異性強、靈敏度高的優勢，提高檢測結果的準確度，并為臨床治療或預防子癇前期提供新靶點。
2、本專利技術采取的技術方案是，提供has-mir-93-5p和/或ccnd1的檢測試劑在制備診斷子癇前期的產品中的應用。進一步地，所述產品包括：芯片、制劑、試劑盒和/或核酸膜條。進一步地，所述試劑包括：特異性擴增has-mir-93-5p的引物；和/或特異性結合ccnd1蛋白的抗體或配體。進一步地，所述引物為has-mir-93-5p的正向引物，引物序列包括caaagtgctg?ttcgt?gc。
3、has-mir-93-5p已經被證實在妊娠早期及中期胎盤高豐度表達。在本專利技術的一個實施例中，驗證了has-mir-93-5p在子癇前期胎盤組織中的表達異常上調，且has-mir-93-5p的上調顯著抑制了滋養層細胞系htr8/svneo的增殖，并損害了其侵襲和遷移能力。roc分析表明，has-mir-93-5p對子癇前期的診斷具有高特異性和靈敏性。所以，可以通過has-mir-93-5p的相關引物檢測其表達水平，用于制備診斷子癇前期的產品如芯片、制劑、試劑盒和/或核酸膜條。在此基礎上，本專利技術還通過雙熒光素酶報告基因檢測證明了has-mir-93-5p與ccnd1mrna3'非翻譯區之間的靶向關系，揭示了has-mir-93-5p異常上調導致子癇前期發生的可能細胞生物學及分子生物學機制，即has-mir-93-5p的上調可通過靶向并下調ccnd1蛋白表達水平來抑制滋養層細胞的增殖并損害其侵襲和遷移能力，從而參與子癇前期的病理發展進程。所以，has-mir-93-5p上調及其下游靶標ccnd1表達下調(及免疫組化分析中ccnd1陽性滋養層細胞占比下調)可以作為聯合診斷標志應用于診斷甚至預測子癇前期的發生。
4、本專利技術的另一目的在于，提供一種子癇前期診斷試劑盒，包括has-mir-93-5p引物和/或ccnd1抗體，所述引物序列包括caaag?tgctg?ttcgt?gc。
5、在本專利技術的一個實施例中，申請人基于has-mir-93-5p的全長cdna序列以及加尾法，設計了has-mir-93-5p引物，用于cdna合成及特異性pcr擴增，其中正向引物has-mir-93-5p-f的序列為caaagtgctgttcgtgc，反向引物為試劑盒自帶通用引物。所述正向引物能夠作為子癇前期診斷試劑盒的核心組分。
6、本專利技術的另一目的在于，提供has-mir-93-5p和/或ccnd1作為藥物靶點在制備子癇前期治療藥物中的應用。進一步地，所述藥物靶向抑制has-mir-93-5p的轉錄和/或上調ccnd1蛋白水平。
7、在本專利技術的一個實施例中，揭示了has-mir-93-5p異常上調導致子癇前期發生的可能細胞生物學及分子生物學機制，即has-mir-93-5p的上調可能通過靶向并下調ccnd1來抑制滋養層細胞的增殖并損害其侵襲和遷移能力，從而參與子癇前期的發展。而且該實施例通過實驗證明了所述靶點受到抑制后能改善胎盤絨毛滋養層細胞的增殖特性，并加強胎盤絨毛外滋養層細胞的侵潤特性。因此，has-mir-93-5p的轉錄加工以及ccnd1的轉錄、翻譯和加工的過程均能作為子癇前期治療的靶點，應用于相應的藥物制備中，對于治療和預防先兆子癇具有重要意義。
8、本專利技術的另一目的在于，提供一種has-mir-93-5p的檢測探針，包括has-mir-93-5p的正向引物，引物序列包括caaag?tgctg?ttcgt?gc。
9、本專利技術的另一目的在于，提供一種ccnd1的檢測探針，包括正向引物序列gctgcgaagt?ggaaaccatc，和/或反向引物序列cctcc?ttctg?cacac?atttg?aa。
10、本專利技術實施例基于加尾法設計的has-mir-93-5p特異性正向引物，并提供了配套的胎盤has-mir-93-5p實時定量rt-pcr檢測分析方案，具有pcr擴增高效性和特異性的特點；且證實了ccnd1也是一個子癇前期診斷標志物，并設計和構建了ccnd1的高效且特異性檢測的pcr引物對。其用途不應當受限于子癇前期的診斷和治療，還可以用于其他科學研究、妊娠相關疾病的臨床研究以及商業用途。
11、與現有技術相比，本專利技術的有益效果為：
12、本專利技術揭示了has-mir-93-5p異常上調導致子癇前期發生的可能細胞生物學及分子生物學機制，將has-mir-93-5p及其下游靶標ccnd1作為子癇前期的聯合診斷標志物，has-mir-93-5p轉錄水平上調及ccnd1蛋白水平或免疫組化陽性細胞占比的下調，可應用于子癇前期診斷或預測，其檢測結果的準確度高，具有特異性強、靈敏度高的優勢，為子癇前期的診斷或篩查提供可靠信息。同時本專利技術所提供的體外功能研究數據還表本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.has-miR-93-5p和/或CCND1的檢測試劑在制備診斷子癇前期的產品中的應用。
2.根據權利要求1所述的一種應用，其特征在于，所述產品包括：芯片、制劑、試劑盒和/或核酸膜條。
3.根據權利要求1所述的一種應用，其特征在于，所述試劑包括：
4.根據權利要求3所述的一種應用，其特征在于，所述引物為has-miR-93-5p的正向引物，引物序列包括CAAAG?TGCTG?TTCGT?GC。
5.一種子癇前期診斷試劑盒，其特征在于，包括has-miR-93-5p引物和/或CCND1抗體，所述引物序列包括CAAAG?TGCTG?TTCGT?GC。
6.has-miR-93-5p和/或CCND1作為藥物靶點在制備子癇前期治療藥物中的應用。
7.根據權利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物靶向抑制has-miR-93-5p的轉錄和/或上調CCND1蛋白水平。
8.一種has-miR-93-5p的檢測探針，其特征在于，包括has-miR-93-5p的正向引物，引物序列包括CAAAG?TGCTG?TT
9.一種CCND1的檢測探針，其特征在于，包括正向引物序列GCTGC?GAAGT?GGAAA?CCATC，和/或反向引物序列CCTCC?TTCTG?CACAC?ATTTG?AA。
...【技術特征摘要】
1.has-mir-93-5p和/或ccnd1的檢測試劑在制備診斷子癇前期的產品中的應用。
2.根據權利要求1所述的一種應用，其特征在于，所述產品包括：芯片、制劑、試劑盒和/或核酸膜條。
3.根據權利要求1所述的一種應用，其特征在于，所述試劑包括：
4.根據權利要求3所述的一種應用，其特征在于，所述引物為has-mir-93-5p的正向引物，引物序列包括caaag?tgctg?ttcgt?gc。
5.一種子癇前期診斷試劑盒，其特征在于，包括has-mir-93-5p引物和/或ccnd1抗體，所述引物序列包括caaag?tgctg?ttcgt?gc...
【專利技術屬性】
技術研發人員：昌文林，古艷麗，董宇，吳傳安，羅麗瓊，蔣濤濤，
申請(專利權)人：深圳市龍華區人民醫院，
類型：發明
國別省市：
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