【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于代謝工程領域，涉及一種提高梭菌合成氣利用的方法，具體涉及一種提升永達爾梭菌(clostridium?ljungdahlii)利用一碳氣體(co2、co)能力的方法。
技術介紹
1、近年來，以二氧化碳(co2)為代表的一碳氣體生物轉化利用技術引起廣泛關注。通過生物發酵來吸收和利用co2等一碳氣體，并將其轉化為各類高附加值的化學品和燃料，不僅有助于緩解co2大量排放所引起的環境問題，也有助于以co2為資源的新一代生物制造產業的形成和發展。
2、永達爾梭菌(clostridium?ljungdahlii)是一種化能固碳微生物，最早從雞場廢物中分離出來(tanner等，1993，doi:10.1099/00207713-43-2-232)，可將二氧化碳(co2)和一氧化碳(co)作為唯一碳源，通過其自身的還原性乙酰輔酶a途徑(也稱為wood-ljungdahl途徑)轉化為乙酰輔酶a，并進一步合成乙酸、乙醇等產物(bengelsdorf等，2018，doi:10.1016/bs.aambs.2018.01.002)。目前已知的天然生物固碳途徑中，wood-ljungdahl途徑是反應步驟最少且耗能最低的(gong等，2016，doi:10.1007/s11427-016-0304-2)。但目前永達爾梭菌發酵一碳氣體的利用效率相比于糖類等有機碳源仍然偏低，需要進一步提升來滿足更高的工業應用需求。
3、微生物通常含有大量的轉錄因子編碼基因。轉錄因子是一類調控蛋白，在微生物體內可調節大量基因的轉錄和表達，因
4、自2022年起，專利技術人提出以下設想：以c.ljungdahlii為研究對象，通過實驗室前期開發的crispr-cas9基因組編輯系統(huang等，2016，doi:10.1021/acssynbio.6b00044)對永達爾梭菌中所有可能的轉錄因子編碼基因進行敲除，同時也使用質粒過表達系統對這些轉錄因子編碼基因進行過量表達。其次，將上述的基因敲除或過表達菌株在合成氣(一氧化碳、二氧化碳、氫氣和氮氣的混合氣)中進行發酵，觀察菌株生長和產物合成能力的變化，從中發現重要的轉錄因子。
技術實現思路
1、我們對永達爾梭菌中可能的轉錄因子編碼基因進行了逐一的敲除以及過表達，并對突變菌株進行了合成氣的發酵，比較突變株和原始菌株的生長以及產物合成能力的差異。在鑒定過程中，發現了敲除轉錄因子nrdr編碼的基因clju_c12350后，突變菌株合成氣發酵時生長和產物(乙酸、乙醇)產量比原始菌株有顯著提高。在進一步的研究中，對上述預測的轉錄因子編碼基因進行了逐一的過表達，所獲得的工程菌株也在合成氣中進行培養，比較工程菌株和原始菌株的生長和產物合成能力的差異，并從中發現過量表達轉錄因子deor的編碼基因clju_c20610，工程菌株產物(乙酸和乙醇)的合成能力比原始菌株顯著提高。接著，對轉錄因子deor編碼基因clju_c20610的表達進行優化以提高c.ljungdahlii菌株的氣體發酵性能，通過使用不同強度的啟動子ppta、pptb、p01440和pthl來驅動clju_c20610基因的表達，并將對應的工程菌在合成氣中進行培養，結果顯示，使用啟動子pthl過表達基因clju_c20610的效果最好，可以顯著提升菌株合成氣發酵時的生長和產物(乙酸和乙醇)產量。基于上述研究成果，本專利技術提供了如下技術方案：
2、一種提高梭菌利用一碳氣體能力的方法，包括下述步驟：
3、a.阻斷或下調轉錄因子nrdr(ncbi登錄號clju_c12350，genbank:adk14303.1)的表達；和/或
4、b.強化轉錄因子deor(ncbi登錄號clju_c20610，genbank:adk15123.1)的表達。
5、本領域技術人員容易理解，蛋白質表達的阻斷方式包括但不限于敲除或者失活等使編碼基因喪失原有功能的方式。
6、上述一碳氣體可以是合成氣，例如是富含co2/co的鋼廠尾氣。
7、優選地，上述梭菌是能夠轉化和利用c1氣體的食氣梭菌，優選永達爾梭菌(clostridium?ljungdahlii)，例如永達爾梭菌c.ljungdahlii?dsm?13528。
8、在一種實施方式中，上述步驟a中通過基因編輯技術實施阻斷轉錄因子nrdr編碼基因的表達。
9、上述基因編輯技術選自下組：同源雙交換，talen系統，crispr-cas9系統，crispr-cpf1系統，crispr-best系統，mugent。
10、在一種實施方式中，上述步驟b是使用一個或多個拷貝的調控元件激活所述轉錄因子deor的活性或者增強所述轉錄因子deor的表達。
11、上述調控元件可以是選自下組的啟動子：ppta、pptb、p01440、p1339和pthl，優選為啟動子pthl。雖然就強度而言，在這幾個啟動子中pthl并不是最強，但實驗比較發現，轉錄因子deor在啟動子pthl調控下的表達可最有效地促進菌株的生長、乙酸和乙醇的產量，表明在梭菌中兩者的適配性最佳，可以顯著提升菌株發酵合成氣時的生長和產物(乙酸和乙醇)產量。
12、在一種實施方式中，可以通過基因編輯技術將所述調控元件即所述啟動子整合于宿主細胞的基因組中轉錄因子deor基因的上游，從而將轉錄因子deor基因置于所述啟動子的調控下。
13、上述基因編輯技術可以選自下組：同源雙交換，talen系統，crispr-cas9系統，crispr-cpf1系統，crispr-best系統，mugent。
14、在另一種實施方式中，步驟b可以是將轉錄因子deor的編碼基因亞克隆于適合于在梭菌中表達的質粒載體上，然后通過熱激法、化學轉化法或者電轉化方法將重組質粒轉入宿主細胞中，從而使轉錄因子deor在梭菌中過表達。
15、優選地，上述質粒載體選自下組：pmtl?82151、pmtl?83151、pmtl?84151、pmtl85151、pmtl?82251、pmtl?82254、pmtl?83251、pmtl?83254、pmtl?84251、pmtl?84254、pmtl85251、pmtl?85254、pimp1。
16、上述重組質粒包含轉錄因子deor的編碼基因和用于調控其表達的選自下組的啟動子：ppta、pptb、p01440、p1339和pthl。
17、本專利技術的第二個方面提供了一種用于在食氣梭菌中表達轉錄因子deor的重組質粒，其選自下組：核苷酸序列為seq?id?no:1的p1339-deor、核苷酸序列為seq?id?no:2的ppta-deor、核苷酸序列為seq?id?no本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種提高梭菌利用一碳氣體能力的方法，其特征在于，包括下述步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述梭菌是能夠轉化和利用一碳氣體的食氣梭菌，優選永達爾梭菌(Clostridium?ljungdahlii)。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟A中通過基因編輯技術實施阻斷轉錄因子NrdR編碼基因的表達。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B是使用一個或多個拷貝的調控元件激活所述轉錄因子DeoR的活性或者增強所述轉錄因子DeoR的表達；或者
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述調控元件是選自下組的啟動子：Ppta、Pptb、P01440、P1339和Pthl，優選為啟動子Pthl。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟B是將轉錄因子DeoR的編碼基因克隆于適合于在梭菌中表達的質粒載體上，然后將重組質粒轉入宿主細胞中，從而使轉錄因子DeoR在梭菌中過表達。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述質粒載體選自下組：pMTL?82151、pMTL83151、pM
8.一種用于表達轉錄因子DeoR的重組質粒，其選自下組：核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1的P1339-deoR、核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2的Ppta-deoR、核苷酸序列為SEQ?ID?NO:3的Pptb-deoR、核苷酸序列為SEQ?ID?NO:4的P01440-deoR和核苷酸序列為SEQ?ID?NO:5的Pthl-deoR。
9.一種能利用一碳氣體的梭菌工程菌，其特征在于，按照如權利要求1-7中任一項所述的方法構建得到。
10.如權利要求9所述的梭菌工程菌在一碳氣體生物利用中的用途，例如梭菌工程菌通過發酵將一碳氣體轉化為乙醇和/或乙酸。
...【技術特征摘要】
1.一種提高梭菌利用一碳氣體能力的方法，其特征在于，包括下述步驟：
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述梭菌是能夠轉化和利用一碳氣體的食氣梭菌，優選永達爾梭菌(clostridium?ljungdahlii)。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟a中通過基因編輯技術實施阻斷轉錄因子nrdr編碼基因的表達。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b是使用一個或多個拷貝的調控元件激活所述轉錄因子deor的活性或者增強所述轉錄因子deor的表達；或者
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述調控元件是選自下組的啟動子：ppta、pptb、p01440、p1339和pthl，優選為啟動子pthl。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟b是將轉錄因子deor的編碼基因克隆于適合于在梭菌中表達的質粒載體上，然后將重組質粒轉入宿主細胞中，從而使轉錄因子deor在梭菌中過表達。
7.如權利要求6所述的...
【專利技術屬性】
技術研發人員：顧陽，張煥，李德茂，姜衛紅，
申請(專利權)人：中國科學院分子植物科學卓越創新中心，
類型：發明
國別省市：
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