【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及蛋白純化，尤其涉及一種糖蛋白的純化方法。
技術介紹
1、目前有幾種純化分離目的蛋白的方法：包括凝集素親和色譜法和陰離子交換色譜法。其中，凝集素親和色譜法是基于凝集素(一種能特異性識別和結合特定糖結構的蛋白質)與糖蛋白之間的相互作用的提取方法。在該方法中，凝集素被固定在色譜介質上，形成一個色譜柱。當含有目標糖結構的糖蛋白樣品通過此色譜柱時，糖蛋白中的特定糖基結構會與凝集素結合。這種結合具有一定特異性，允許糖蛋白從混合物中被有效地捕獲。隨后，通過使用含有高濃度特定糖類分子的洗脫緩沖液，可以實現糖蛋白與凝集素的競爭性解離，從而達到糖蛋白的純化和分離?；谏鲜鲈?，設計與硫酸乙酰肝素化sdc2結合的凝集素，形成特定色譜柱后，使總蛋白質混合物通過，最后洗脫糖蛋白完成純化分離。
2、陰離子交換色譜法的原理為：基于帶負電荷的分子(如某些糖蛋白)與色譜介質上的陽離子之間的電荷相互作用。在這種方法中，帶負電的糖蛋白分子會被固定在介質上的陽離子(如deae或q?sepharose)捕獲。通過改變洗脫液的ph值或鹽濃度，可以特異性地洗脫和收集目標分子。基于以上原理，在提取總蛋白質后，通過陰離子交換色譜柱，然后洗脫非目標蛋白，再改變洗脫緩沖液ph值或鹽濃度，特異性洗脫和收集目標糖蛋白。
3、這些方法有如下限制：(1)特異性限制：某些凝集素的結合能力可能覆蓋多種糖結構，而非局限于單一糖結構，這可能降低特定糖蛋白的選擇性純化效果。相似地，陰離子交換色譜法在分離電荷特性相近的分子方面也存在限制。(2)實驗條件設置的復雜性
4、綜上，現有提取糖蛋白的方案特異性欠佳、實驗條件設置復雜且可用性有限，不適合用于特異性純化糖蛋白，尤其是分離和純化新發現或結構未明的糖基化修飾糖蛋白。因此，亟需開發一種新的特異性高、簡便的蛋白純化分離的方法。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供一種糖蛋白的純化方法，只需獲得蛋白序列和相應的糖修飾酶序列，即可分離純化特定修飾的蛋白多糖。
2、為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案為：
3、第一方面，本專利技術提供了一種糖蛋白的純化方法，包括如下步驟：
4、(1)根據糖蛋白的核心蛋白設計質粒a進行核心蛋白的富集；
5、(2)根據糖修飾酶設計質粒b進行體糖鏈修飾；
6、(3)將質粒a和質粒b共同轉染目的細胞；
7、(4)裂解細胞提取總蛋白；
8、(5)純化總蛋白得到所述糖蛋白。
9、本專利技術提供了一種在體糖鏈修飾跨膜蛋白聚糖的純化方法，只需要獲得蛋白序列和相應的糖修飾酶序列，并在蛋白序列中增加his等標簽進行后續純化，即可分離純化特定修飾的蛋白多糖。其中，質粒a用于核心蛋白的富集，質粒b用于進行體糖鏈修飾。質粒a的設計應考慮：盡量涵蓋編碼蛋白序列的cds區域，選擇添加分子量小的標簽蛋白，例如6×his，標簽蛋白添加位置應根據蛋白結構進行調整。以sdc2為例，由于其發生糖基化修飾的位置在胞外段，因此設計質粒a時將標簽蛋白放在胞內段一側，即蛋白序列的c端，防止核心蛋白結構改變無法完成修飾。
10、優選地，所述質粒a含標簽蛋白。
11、更優選地，所述質粒a含his標簽蛋白。
12、優選地，所述糖蛋白包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其核心蛋白包括sdc1、sdc2、sdc3、sdc4、hspg2、gpc1、gpc2、gpc3、gpc4、gpc5、gpc6、agrn。
13、優選地，所述糖蛋白為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，且核心蛋白為sdc2時，質粒a的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
14、優選地，所述糖蛋白為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖時，其糖修飾酶包括hs3st3b1、hs3st1、hs3st2、hs3st3a1、hs3st4、hs3st5、hs3st6、hs6st1、hs6st2、hs3st3、hs2st1、ndst1、ndst2、ndst3、ndst4。
15、優選地，所述糖蛋白為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖時，體糖鏈修飾包括磺基化修飾。
16、優選地，所述磺基化修飾的位點為糖鏈的3-o-s位點時，質粒b的核苷酸序列如seqid?no.2所示。
17、優選地，所述步驟(3)中，目的蛋白包括hek293t細胞。
18、優選地，所述步驟(5)中，純化的方式包括采用磁珠純化。
19、優選地，所述磁珠包括瓊脂糖磁珠。
20、優選地，所述磁珠純化包括如下步驟：
21、(a)將總蛋白與磁珠混合孵育后，磁分離，去除上清；
22、(b)加入洗滌液a重復洗滌；
23、(c)加入洗脫液b孵育，磁分離，收集洗脫液，即得到純化的糖蛋白。
24、優選地，所述步驟(b)中，洗滌液a包括如下質量濃度的組分：10mm?tris、500mmnacl，ph＝7.4。
25、優選地，所述步驟(c)中，洗滌液b包括如下質量濃度的組分：10mm?tris、500mmnacl、500mm?imidazole，ph＝7.4。
26、本專利技術的有益之處在于：
27、因現有提取糖蛋白的方案特異性欠佳、實驗條件設置復雜且可用性有限，不適合用于特異性純化糖蛋白，尤其是分離和純化新發現或結構未明的糖基化修飾糖蛋白。本專利技術提供了一種在體糖鏈修飾跨膜蛋白聚糖的純化方法，只需要獲得蛋白序列和相應的糖修飾酶序列，即可分離純化特定修飾的蛋白多糖。
28、本專利技術所述的純化方法，具有如下優點：
29、(1)特異性高，可以提純分離特定蛋白形成的糖蛋白；
30、(2)實驗條件一致性高，不需要反復摸索；
31、(3)可提純分離復雜或未知糖鏈糖基化修飾的糖蛋白，并對糖鏈進行特定的修飾。
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1.一種糖蛋白的純化方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權利要求1所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述糖蛋白包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其核心蛋白包括SDC1、SDC2、SDC3、SDC4、HSPG2、GPC1、GPC2、GPC3、GPC4、GPC5、GPC6、AGRN。
3.如權利要求2所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述糖蛋白為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，且核心蛋白為SDC2時，質粒A的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
4.如權利要求1所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述糖蛋白為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖時，其糖修飾酶包括HS3ST3B1、HS3ST1、HS3ST2、HS3ST3A1、HS3ST4、HS3ST5、HS3ST6、HS6ST1、HS6ST2、HS3ST3、HS2ST1、NDST1、NDST2、NDST3、NDST4。
5.如權利要求1所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述糖蛋白為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖時，體糖鏈修飾包括磺基化修飾。
6.如權利要求5所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述磺基化修
7.如權利要求1所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述步驟(5)中，純化的方式包括采用磁珠純化。
8.如權利要求7所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述磁珠純化包括如下步驟：
9.如權利要求8所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述步驟(b)中，洗滌液A包括如下質量濃度的組分：10mM?Tris、500mM?NaCl，pH＝7.4。
10.如權利要求8所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述步驟(c)中，洗滌液B包括如下質量濃度的組分：10mM?Tris、500mM?NaCl、500mM?Imidazole，pH＝7.4。
...【技術特征摘要】
1.一種糖蛋白的純化方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.如權利要求1所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述糖蛋白包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，其核心蛋白包括sdc1、sdc2、sdc3、sdc4、hspg2、gpc1、gpc2、gpc3、gpc4、gpc5、gpc6、agrn。
3.如權利要求2所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述糖蛋白為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，且核心蛋白為sdc2時，質粒a的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4.如權利要求1所述的糖蛋白的純化方法，其特征在于，所述糖蛋白為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖時，其糖修飾酶包括hs3st3b1、hs3st1、hs3st2、hs3st3a1、hs3st4、hs3st5、hs3st6、hs6st1、hs6st2、hs3st3、hs2st1、ndst1、ndst2、ndst3、ndst4。
5.如權利要求1所述的糖蛋白...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曾文鋒，陳閩霞，黃鵬翰，陳嘉寧，
申請(專利權)人：中山大學孫逸仙紀念醫院，
類型：發明
國別省市：
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