【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物標(biāo)志物檢測(cè)，具體涉及一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、氧化應(yīng)激被定義為氧化和抗氧化系統(tǒng)不平衡，過(guò)量自由基持續(xù)產(chǎn)生超過(guò)其消除能力的不良應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激相關(guān)自由基主要包括活性氧類(lèi)和活性氮類(lèi)。研究表明，氧化應(yīng)激與神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、代謝綜合征、衰老等生理和病理過(guò)程密切相關(guān)。因此，對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的定量評(píng)價(jià)對(duì)機(jī)體發(fā)病機(jī)制、疾病診斷、藥物研發(fā)等的研究尤為重要。
2、3-硝基-l-酪氨酸（3-nt）是由酪氨酸與活性氮類(lèi)物質(zhì)（如過(guò)亞硝酸根和硝基氯）反應(yīng)產(chǎn)生，是一種公認(rèn)的氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物。3-氯-l-酪氨酸（3-ct）和3-溴-l-酪氨酸（3-bt）分別由酪氨酸與活性氧類(lèi)物質(zhì)次氯酸和次溴酸反應(yīng)形成，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的穩(wěn)定內(nèi)源性生物標(biāo)志物。生物標(biāo)志物是可以被客觀測(cè)量和評(píng)價(jià)的指標(biāo)。對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)生物標(biāo)志物3-ct、3-nt和3-bt的定量測(cè)定可以客觀評(píng)估機(jī)體的不同生理或病理狀態(tài)，對(duì)研究相關(guān)疾病的病理機(jī)制、藥物療效等具有重要意義。
3、由于生物樣本基質(zhì)復(fù)雜，且目標(biāo)分析物含量低，導(dǎo)致無(wú)法直接對(duì)生物樣本中目標(biāo)分析物進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量。因此需要選擇合適的樣品前處理方法對(duì)樣本中目標(biāo)分析物選擇性富集，并達(dá)到除去雜質(zhì)的目的。目前，復(fù)雜樣品中3-ct、3-nt和3-bt測(cè)定的樣品前處理方法主要包括衍生化和固相萃取技術(shù)。衍生化方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，而且可能存在衍生化不完全和產(chǎn)生副產(chǎn)物的問(wèn)題。固相萃取技術(shù)多采用市售的固相萃取柱，如c-18?bond?elutcartridges，c
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法和應(yīng)用，用以解決現(xiàn)有的檢測(cè)方法存在低通量的技術(shù)問(wèn)題。
2、為了達(dá)到上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
3、本專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，包括以下步驟：
4、采用單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑為原料制備poly(vim- co-edma)離心柱；
5、依次使用硝酸鋅的甲醇溶液、甲醇、咪唑類(lèi)似物的甲醇溶液和甲醇沖洗poly(vim- co-edma)離心柱的表面，得到mofs@poly(vim- co-edma)離心柱；所述mofs@poly(vim- co-edma)離心柱的表面具有配位聚合物；
6、使用mofs@poly(vim- co-edma)離心柱對(duì)待測(cè)樣品溶液中的生物標(biāo)志物進(jìn)行選擇性萃取富集，進(jìn)行生物標(biāo)志物的含量測(cè)定。
7、進(jìn)一步地，所述制備poly(vim- co-edma)離心柱的具體步驟為：
8、將單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑混合后，得到預(yù)聚液；
9、將預(yù)聚液注入空的離心柱內(nèi)，在密閉條件下加熱進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到poly(vim- co-edma)離心柱。
10、進(jìn)一步地，所述述單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比為（40~50）：（95~115）：（320~380）：（1.2~1.8）。
11、進(jìn)一步地，所述單體為1-乙烯基咪唑；所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述致孔劑為丙醇/1,4-丁二醇；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈；
12、所述致孔劑中，丙醇和1,4-丁二醇的重量比為（125~155）：（195~225）。
13、進(jìn)一步地，所述預(yù)聚液的體積大于或等于150?μl；
14、所述聚合反應(yīng)的溫度為65~75℃，時(shí)間為10~14?h。
15、進(jìn)一步地，所述硝酸鋅的甲醇溶液濃度為5~15?mm，體積為1~1.5?ml；
16、所述咪唑類(lèi)似物包括2-甲基咪唑、苯并咪唑、5,6-二甲基苯并咪唑、萘并[2,3-d]咪唑、9,10-菲咪唑、4-苯基咪唑和4,5-二苯基咪唑中的一種；所述咪唑類(lèi)似物的甲醇溶液濃度為5~15?mm，體積為2~3?ml。
17、進(jìn)一步地，所述配位聚合物的層數(shù)大于或等于一層。
18、進(jìn)一步地，使用mofs@poly(vim- co-edma)離心柱對(duì)待測(cè)樣品溶液中的生物標(biāo)志物進(jìn)行選擇性萃取富集，進(jìn)行生物標(biāo)志物的含量測(cè)定，具體包括以下步驟：
19、按照離心式微固相萃取的方式，使用mofs@poly(vim- co-edma)離心柱對(duì)待測(cè)樣品溶液中的生物標(biāo)志物進(jìn)行選擇性萃取富集，并進(jìn)一步采用洗脫溶劑進(jìn)行解吸附，收集洗脫液進(jìn)行生物標(biāo)志物的含量測(cè)定；
20、所述待測(cè)樣品溶液的ph值為8.0；所述待測(cè)樣品溶液的體積為4.0?ml；所述待測(cè)樣品溶液中在使用之前添加有10mm氯化鈉溶液和體積分?jǐn)?shù)為40%的乙腈。
21、進(jìn)一步地，所述洗脫溶劑為含體積分?jǐn)?shù)為10%甲酸的甲醇。
22、本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了上述選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法在大腸桿菌內(nèi)源性3-ct、3-nt和3-bt的純化與富集中的應(yīng)用。
23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專(zhuān)利技術(shù)具有以下有益效果：
24、本專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，采用特定的單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑進(jìn)行反應(yīng)，得到poly(vim- co-edma)離心柱，隨后依次通入硝酸鋅的甲醇溶液、咪唑類(lèi)似物的甲醇溶液進(jìn)行反應(yīng)，得到mofs@poly(vim- co-edma)離心柱；通過(guò)離心式微固相萃取的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品溶液中的生物標(biāo)志物的純化與富集；該方法建立了一種有效富集和高靈敏分析氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的新方法，通過(guò)在poly(vim- co-edma)離心柱表面引入配位聚合物，提高了吸附劑對(duì)目標(biāo)分析物的萃取和富集效果，解決了現(xiàn)有的檢測(cè)方法存在低通量的技術(shù)問(wèn)題。
25、進(jìn)一步地，通過(guò)離心式微固相萃取的方式實(shí)現(xiàn)大腸桿菌內(nèi)源性3-ct、3-nt和3-bt的純化與富集；該方法建立了一種有效富集和高靈敏分析氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物3-ct、3-nt和3-bt的新方法，通過(guò)在poly(vim- 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述制備poly(VIM-co-EDMA)離心柱的具體步驟為：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比為（40~50）：（95~115）：（320~380）：（1.2~1.8）。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述單體為1-乙烯基咪唑；所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述致孔劑為丙醇/1,4-丁二醇；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈；
5.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述預(yù)聚液的體積大于或等于150?μL；
6.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述硝酸鋅的甲醇溶液濃度為5~15?mM，體積為1~1.5?
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述配位聚合物的層數(shù)大于或等于一層。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，使用MOFs@poly(VIM-co-EDMA)離心柱對(duì)待測(cè)樣品溶液中的生物標(biāo)志物進(jìn)行選擇性萃取富集，進(jìn)行生物標(biāo)志物的含量測(cè)定，具體包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述洗脫溶劑為含體積分?jǐn)?shù)為10%甲酸的甲醇。
10.權(quán)利要求1~9中任意一項(xiàng)所述的選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法在大腸桿菌內(nèi)源性3-CT、3-NT和3-BT的純化與富集中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述制備poly(vim-co-edma)離心柱的具體步驟為：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述單體、交聯(lián)劑、致孔劑和引發(fā)劑的質(zhì)量比為（40~50）：（95~115）：（320~380）：（1.2~1.8）。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述單體為1-乙烯基咪唑；所述交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述致孔劑為丙醇/1,4-丁二醇；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈；
5.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種選擇性富集氧化應(yīng)激相關(guān)重要生物標(biāo)志物的分析方法，其特征在于，所述預(yù)聚液的體積大于或等于150?μl；
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【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王欣，周文秀，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海交通大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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