【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學，具體地說是一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法及其活性評價。
技術介紹
1、多肽藥物作為腫瘤、免疫以及體內激素調節等方面的治療藥物，廣泛應用于許多疾病領域，包括糖尿病、癌癥、hiv感染等。多肽藥物具有很長的發展歷史，自1921年合成第一個治療性肽胰島素以來，世界范圍內已有100多種肽類藥物獲得批準，因此，多肽類藥物的開發也成為藥學研究的熱點之一。多肽類藥物具有低免疫原性，低成本和高選擇性等優勢，但也存在體內穩定性弱和半衰期短等缺點。
2、蜂毒取自蜜蜂工蜂的毒腺以及副腺，為蛋白質多肽類、生物胺類和非蛋白物質組成的混合物。其中蜂毒肽(melittin)是蜂毒中的重要活性成分。蜂毒肽具有潛在膜活性，其寡聚體可在細胞膜上形成親水性小孔干擾磷脂雙分子層的完整性，使胞內物質滲漏造成滲透壓改變，繼而導致細胞組織的溶解。單獨的蜂毒肽對于細胞毒性過高，在安全劑量的范圍內不能表現出很好的抗腫瘤效果，同時在體內的穩定性很差，發揮藥效之前就被酶解了。
3、通過對melittin進行修飾可以提高多肽的活性，增強多肽的藥動學穩定性和通透性，延長多肽的半衰期，降低毒性。修飾多肽的方法主要分為兩類，一類是針對肽鏈骨架的改造，另一類是在多肽骨架不變的基礎上，在氮端和碳端引入其他基團進行結構優化和性能改造，包括聚乙二醇修飾、蛋白融合策略和膽固醇修飾等。
4、聚乙二醇(peg)一種高分子材料，通常溶于水和多種有機溶劑，具有良好的穩定性和相容性。peg修飾技術廣泛應用于多種蛋白質和多肽的化學修飾。peg修飾
5、由于現有melittin在體內易降解、毒性過大等諸多局限性，因此提出了在蜂毒肽的n端和c端連接不同長度peg的修飾方法和活性評價策略，從而提升蜂毒肽的體內穩定性，并調控其毒性，降低全身毒副作用，以增加蜂毒肽的應用范圍。
技術實現思路
1、為了解決上述技術問題，本專利技術提供一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法及其活性評價，目的是克服現有蜂毒肽的生物穩定性差、全身毒副作用大的不足，提供在蜂毒肽n端和c端修飾不同長度peg的合成方法，提高蜂毒肽的體內穩定性，并實現對蜂毒肽毒性的調控，降低毒性。
2、根據本公開的第一方面，提出了一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，包括以下步驟：
3、s1、以n二氯樹脂為載體加入二氯甲烷dcm溶脹半小時，抽掉dcm，加入序列中2n的第一個氨基酸，加入2n的二異丙基乙胺diea和二甲基甲酰胺dmf及dcm，二異丙基乙胺、二甲基甲酰胺、二氯甲烷，氮氣鼓泡反應60min，再加入甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用dmf、meoh洗凈；
4、s2、往反應器中加入序列中第二個氨基酸2n，2n的1－羥基，苯并，三氯唑四甲基六氟磷酸鹽hbtu及diea，n2鼓泡反應半小時，洗掉液體，茚三酮檢測，用吡啶和乙酸酐封端，再洗凈，加入脫帽液去除9-芴甲氧羰基fmoc保護基，洗凈，茚三酮檢測；
5、s3、按照s2步驟方式依次加入序列中不同氨基酸并進行修飾；
6、s4、將樹脂用氮氣吹干后從反應柱中取下，倒入燒瓶中，往燒瓶中加入切割液，震蕩，濾掉樹脂；得到濾液，向濾液中加入乙醚，析出粗產物，再離心，清洗，得到序列的粗產物；用高效液相色譜將粗品提純，并進行質譜測定修飾肽的成功合成。
7、優選的，所述s1加入的二甲基甲酰胺dmf和二氯甲烷dcm的量為能夠使樹脂充分鼓動的量。
8、優選的，所述s4加入的切割液的量按照與樹脂的比例為10ml/克進行添加。
9、優選的，所述切割液的組成是95％tfa，2％乙二硫醇，2％三異丙基硅烷，1％水。
10、根據本公開的第二方面，提出了一種不同長度的連接臂修飾多肽的活性評價，采用抗腫瘤多肽蜂毒肽melittin為模型，所述melittin分別進行n端和c端的聚乙二醇化peg，通過固相合成方法合成melittin多肽鏈，合成過程將不同長度的peg連接到melittin的n端和c端，形成不同類型peg修飾端的melittin多肽鏈。
11、優選的，所述多肽修飾鏈的peg重復單元為4-200。
12、與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果：
13、本專利技術基于多肽固相合成技術合成不同長度peg修飾的蜂毒肽，操作簡單、易于生產。所制備的蜂毒肽多肽藥物，分別在n/c端修飾不同長度的peg，提高蜂毒肽在體內的穩定性。其中n端修飾的peg可以有效降低melittin對細胞的毒性，并隨著peg長度的增加，其毒性逐漸減??；而c端修飾peg對蜂毒肽的毒性幾乎沒有影響。
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1.一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，其特征在于：所述S1加入的二甲基甲酰胺DMF和二氯甲烷DCM的量為能夠使樹脂充分鼓動的量。
3.如權利要求1所述一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，其特征在于：所述S4加入的切割液的量按照與樹脂的比例為10mL/克進行添加。
4.如權利要求3所述一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，其特征在于：所述切割液的組成是95％TFA，2％乙二硫醇，2％三異丙基硅烷，1％水。
5.一種不同長度的連接臂修飾多肽的活性評價，根據權利1-4任一所述的制備方法制得的不同長度的連接臂修飾多肽，其特征在于：采用抗腫瘤多肽蜂毒肽Melittin為模型，所述Melittin分別進行N端和C端的聚乙二醇化PEG，通過固相合成方法合成Melittin多肽鏈，合成過程將不同長度的PEG連接到Melittin的N端和C端，形成不同類型PEG修飾端的Melittin多肽鏈。
6.如權利要求5所述一種不同長度的連接臂修飾多
...【技術特征摘要】
1.一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，其特征在于：所述s1加入的二甲基甲酰胺dmf和二氯甲烷dcm的量為能夠使樹脂充分鼓動的量。
3.如權利要求1所述一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，其特征在于：所述s4加入的切割液的量按照與樹脂的比例為10ml/克進行添加。
4.如權利要求3所述一種不同長度的連接臂修飾多肽的制備方法，其特征在于：所述切割液的組成是95％tfa，2％乙二硫醇，2％三異丙基硅烷...
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