【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種基于蛋白支架的自組裝交聯酶聚集體及其制備方法。
技術介紹
1、目前改善酶性質的技術包括定向進化、位點定向突變、酶的融合、表面展示和酶固定化(l.q.e.a.cao,2003；madhavan?et?al.,2017)。固定化技術可克服游離酶催化效率低、難以重復使用、缺乏穩定性等不足。固定化酶技術推動了發酵工業和其他相關行業的發展?；谳d體的固定方法因載體與酶之間的相互作用易引起酶結構的變化，從而導致酶失活。固定載體通常具有一定體積，由于擴散限制，不適合大分子底物的催化反應(roessl?etal.,2010)。而且由于酶和載體材料通常具有完全不同的性狀，簡單的將其通過共價鍵連接有可能會破壞酶的三級結構，使酶鈍化或失活。
2、無載體固定化酶的制備無需額外固體載體，可將蛋白酶直接交聯得到。cao?etal.(2000)把結晶法用更簡單、更便宜的沉淀法取代，在不變性的情況下先形成酶分子的物理聚集，隨后進一步交聯，首次成功構建了交聯酶聚集體(cleas)。與傳統的載體固定化酶相比，無載體交聯酶生物催化體系具有一些明顯的優點，如催化劑比表面積高，催化活性高，在極端條件和有機溶劑中操作穩定性良好，成本顯著降低。雖然交聯酶聚集體技術已經成功應用于多種酶的固定化中，但是由于常用交聯劑戊二醛等對蛋白質表面反應位點選擇性較低，導致酶的三級結構變形，進而影響酶活力。此外，由于不同種類、不同來源的酶由于表面賴氨酸分布數量及位置不同，在制備交聯酶聚集體時需要分別優化沉淀、交聯過程，導致交聯酶聚集體的制備技術存在
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的在于提供了一種基于蛋白支架的自組裝交聯酶聚集體及其制備方法，基于蛋白支架的自組裝交聯酶聚集體及其制備方法最大限度保留了酶的構象及酶活，同時提高了熱穩定性及重復使用性能。
2、為解決上述技術問題，本專利技術提供了以下技術方案：
3、本專利技術提供一種基于蛋白支架的自組裝交聯酶聚集體，與spytag相連的酶連接至spycatcher蛋白支架構成自組裝交聯酶聚集體；所述spycatcher蛋白的氨基酸序列如seqid?no:1所示。
4、優選的，所述與spytag相連的酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶中的一種或幾種。
5、優選的，與spytag相連的內切葡聚糖酶的氨基酸序列如seq?id?no:2所示，與spytag相連的纖維二糖水解酶的氨基酸序列如seq?id?no:3所示，與spytag相連的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
6、本專利技術還提供所述的自組裝交聯酶聚集體的制備方法，包括如下步驟：硫酸銨和spycatcher蛋白混合得沉淀spycatcher蛋白；沉淀spycatcher蛋白和戊二醛交聯得spycatcher蛋白支架；與spytag相連的酶和spycatcher蛋白支架混合，得自組裝交聯酶聚集體。
7、優選的，所述spycatcher蛋白和硫酸銨的體積比為1:1-1:5。
8、優選的，所述硫酸銨和spycatcher蛋白混合的溫度為2-6℃，時間為0.5-2h。
9、優選的，所述戊二醛和沉淀spycatcher蛋白的質量比為50:1-1:1。
10、優選的，所述交聯的溫度為23-27℃，時間為1-5h。
11、優選的，所述與spytag相連的酶和spycatcher蛋白支架摩爾比為1:15-25。
12、優選的，所述與spytag相連的酶和spycatcher蛋白支架混合的溫度為23-27℃、時間為1-3h、速度為50-150rpm。
13、與現有技術相比，本專利技術具有如下有益效果：
14、本專利技術先利用基因工程手段合成k4-(ggggs)2-spycatcher-his6蛋白質單體，之后用硫酸銨沉淀、戊二醛交聯的方式獲得交聯k4-(ggggs)2-spycatcher-his6蛋白支架(簡稱spycatcher蛋白支架)。該構建的spycatcher蛋白支架的結合能力可在4℃環境下保持至少28天，具有普適性。通過spycatcher和spytag之間的特異性結合作用，任何和spytag相連的酶分子都可以位點特異性的連接至交聯spycatcher蛋白支架成為交聯酶聚集體，解決了現有交聯酶聚集體制備需單獨優化步驟和酶失活問題。
15、進一步的，本專利技術利用spycatcher-spytag之間的特異性親和作用，通過自組裝將egl01-st、cel5a-h38-st和hohc94-st的融合蛋白或xynz-st與交聯k4-(ggggs)2-spycatcher-his6蛋白支架結合，得到的自組裝交聯酶聚集體最大限度保留了酶的構象及酶活，同時提高了熱穩定性及重復使用性能。
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1.一種基于蛋白支架的自組裝交聯酶聚集體，其特征在于，與SpyTag相連的酶連接至SpyCatcher蛋白支架構成自組裝交聯酶聚集體；
2.如權利要求1所述的自組裝交聯酶聚集體，其特征在于，所述與SpyTag相連的酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶中的一種或幾種。
3.如權利要求2所述的自組裝交聯酶聚集體，其特征在于，與SpyTag相連的內切葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示，與SpyTag相連的纖維二糖水解酶的氨基酸序列如SEQID?NO:3所示，與SpyTag相連的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。
4.如權利要求1-3任一項所述的自組裝交聯酶聚集體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：硫酸銨和SpyCatcher蛋白混合得沉淀SpyCatcher蛋白；沉淀SpyCatcher蛋白和戊二醛交聯得SpyCatcher蛋白支架；與SpyTag相連的酶和SpyCatcher蛋白支架混合，得自組裝交聯酶聚集體。
5.如權利要求4所
6.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述硫酸銨和SpyCatcher蛋白混合的溫度為2-6℃，時間為0.5-2h。
7.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述戊二醛和沉淀SpyCatcher蛋白的質量比為50:1-1:1。
8.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述交聯的溫度為23-27℃，時間為1-5h。
9.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述與SpyTag相連的酶和SpyCatcher蛋白支架摩爾比為1:15-25。
10.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述與SpyTag相連的酶和SpyCatcher蛋白支架混合的溫度為23-27℃、時間為1-3h、速度為50-150rpm。
...【技術特征摘要】
1.一種基于蛋白支架的自組裝交聯酶聚集體，其特征在于，與spytag相連的酶連接至spycatcher蛋白支架構成自組裝交聯酶聚集體；
2.如權利要求1所述的自組裝交聯酶聚集體，其特征在于，所述與spytag相連的酶包括內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶、內切木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-淀粉酶中的一種或幾種。
3.如權利要求2所述的自組裝交聯酶聚集體，其特征在于，與spytag相連的內切葡聚糖酶的氨基酸序列如seq?id?no:2所示，與spytag相連的纖維二糖水解酶的氨基酸序列如seqid?no:3所示，與spytag相連的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seq?id?no:4所示。
4.如權利要求1-3任一項所述的自組裝交聯酶聚集體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：硫酸銨和spycatcher蛋白混合得沉淀spycatcher蛋白；沉淀spycatcher蛋白和戊二醛交聯得spycatcher蛋白支架；與s...
【專利技術屬性】
技術研發人員：賈麗麗，馬雪亮，楊玉，王曼矚，張宇博，趙秉萱，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：
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