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    一種表達人源CD22的B16細胞的方法技術

    技術編號:44452172 閱讀:4 留言:0更新日期:2025-02-28 18:57
    本發明專利技術涉及質粒構建、質粒轉染、流式檢測與共聚焦顯微鏡成像領域,公開了一種表達人源CD22的B16細胞的方法,其方法包括以下步驟:S1、質粒構建,S2、細胞轉染,S3、單克隆培養。本發明專利技術基于PiggyBac質粒載體系統,設計出CD22表達質粒,并使用轉染試劑將該質粒系統轉染至B16細胞中,再通過流式分選儀對熒光表達陽性的細胞進行單克隆分選,再從單克隆細胞株不斷擴培,最終使用抗體去檢測CD22的表達。

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及質粒構建、質粒轉染、流式檢測與共聚焦顯微鏡成像領域,具體為一種表達人源cd22的b16細胞的方法。


    技術介紹

    1、cd22?car-m是一種具有吞噬腫瘤能力的細胞療法,它通過將cd22標記在t細胞上,使其能夠識別并攻擊體內帶有cd22抗原的腫瘤細胞。這種方法具有許多優點,例如能夠克服傳統免疫療法中存在的局限性,并且能減少對正常組織細胞的損害,目前在對cd22?car-m的吞噬腫瘤能力研究中,均使用表達cd22的懸浮細胞作為靶向對象。car-m能通過其胞外的scfv,特異性的地識別并結合腫瘤的標志物,從而達到吞噬殺傷腫瘤的效果。

    2、然而,目前表達cd22的腫瘤細胞,多為懸浮細胞居多,即使是被報道表達cd22的乳腺癌和肺癌細胞,其表達量相也只有懸浮細胞的0.5%。但為了更好的研究cd22?car-m對實體瘤特殊的吞噬殺傷能力,所以在car-m功能研究中,還需要一個能穩定表達cd22的實體瘤細胞作為靶向對象。


    技術實現思路

    1、本專利技術基于piggybac質粒載體系統,設計出cd22表達質粒,并使用轉染試劑將該質粒系統轉染至b16細胞中。通過流式分選儀對熒光表達陽性的細胞進行單克隆分選,再從單克隆細胞株不斷擴培,最終使用抗體去檢測cd22的表達。

    2、為實現上述目的,本專利技術提供如下技術方案:一種表達人源cd22的b16細胞的方法,其方法包括以下步驟:

    3、s1、質粒構建

    4、(一)實驗器材:

    5、瓊脂糖,goldview核酸染料,相關引物,諾唯贊高保真pcr酶,諾唯贊dna純化回收試劑盒,限制性核酸內切酶,pcr儀,諾唯贊同源重組酶,dh5α感受態細胞,天根去內毒素質粒提取試劑盒;

    6、(二)實驗步驟:

    7、①使用表一中的引物1與引物2,按照表二的反應程序,以課題組內質粒庫中質粒為模板,pcr得到cd22-p2a-mcherry片段,使用pcr產物回收試劑盒將片段回收;

    8、表一cd22-p2a-mcherry引物

    9、

    10、表二cd22-p2a-mcherry片段pcr反應程序

    11、

    12、②使用表三內限制性核酸內切酶,按照表四反應程序,對組內pb載體質粒進行酶切,使用pcr產物回收試劑盒將片段回收;

    13、表三pb載體雙酶切

    14、

    15、表四限制性內切酶反應程序

    16、

    17、③使用同源重組酶,按照表六比例混合上述得到的核酸片段;

    18、④使用dh5α將同源重組產物進行轉化;

    19、⑤挑取單菌落擴培,并送樣測序;

    20、⑥使用去內毒素質粒提取試劑盒,提取質粒,用于后續轉染;

    21、s2、細胞轉染

    22、(一)實驗器材:

    23、2000試劑,opti-men培養基,1640無抗生素培養基,1640完全培養基,pb-cd22-p2a-mcherry質粒,b16細胞,24孔板;

    24、(二)實驗方案:

    25、①提前一晚,24孔板,每孔1×105個b16細胞,加入800μl1640完全培養基培養;

    26、②實驗前將每孔的培養基更換為無雙抗培養基;

    27、③將lipo2000試劑充分顛倒混勻,使用50μl?opti-mem培養基稀釋1.6μllipofectamine試劑,靜置5min;

    28、④使用50μl?opti-mem培養基稀釋0.8μg質粒,靜置5min;

    29、⑤將稀釋的lipo2000試劑逐滴加入稀釋的dna中,即,1:1比例,再吹打混勻,室溫靜置15min;

    30、⑥再次充分混勻dnalipo2000混合液,向每孔細胞添加50μl?dna脂質復合物;

    31、⑦6h后給使用完全培養基細胞進行換液,24h后熒光顯微鏡觀察細胞轉染效率;

    32、s3、單克隆培養

    33、(一)實驗器材:

    34、bd流式細胞分選儀,96孔板,24孔板,2%雙抗1640完全培養基;

    35、(二)實驗方案:

    36、①96孔板中加入100μl?2%雙抗的1640完全培養基;

    37、②使用bd流式細胞分選儀,將轉染陽性的細胞分選至96孔板中,每個孔1個細胞;

    38、③觀察細胞生長情況,待長滿96孔板,并且保持陽性信號,則擴培至24孔板中。

    39、優選的,步驟s1中,pcr儀中50℃反應15min。

    40、優選的,步驟s2中,每個孔使用的最終試劑為1.6μl。

    41、優選的,步驟s2中,最終每孔質粒為0.3μg。

    42、與現有技術相比,本專利技術的有益效果是:

    43、1、本專利技術基于piggybac質粒載體系統,設計出cd22表達質粒,并使用轉染試劑將該質粒系統轉染至b16細胞中;

    44、2、通過流式分選儀對熒光表達陽性的細胞進行單克隆分選,再從單克隆細胞株不斷擴培,最終使用抗體去檢測cd22的表達。

    本文檔來自技高網...

    【技術保護點】

    1.一種表達人源CD22的B16細胞的方法,其特征在于:其方法包括以下步驟:

    2.根據權利要求1所述的一種表達人源CD22的B16細胞的方法,其特征在于:步驟S1中,PCR儀中50℃反應15min。

    3.根據權利要求1所述的一種表達人源CD22的B16細胞的方法,其特征在于:步驟S2中,每個孔使用的最終試劑為1.6μL。

    4.根據權利要求1所述的一種表達人源CD22的B16細胞的方法,其特征在于:步驟S2中,最終每孔質粒為0.3μg。

    【技術特征摘要】

    1.一種表達人源cd22的b16細胞的方法,其特征在于:其方法包括以下步驟:

    2.根據權利要求1所述的一種表達人源cd22的b16細胞的方法,其特征在于:步驟s1中,pcr儀中50℃反應15min。

    3.根據權利要...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:鄭淵哲劉征張智紅
    申請(專利權)人:海南大學
    類型:發明
    國別省市:

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