【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及質粒構建、質粒轉染、流式檢測與共聚焦顯微鏡成像領域，具體為一種表達人源cd22的b16細胞的方法。
技術介紹
1、cd22?car-m是一種具有吞噬腫瘤能力的細胞療法,它通過將cd22標記在t細胞上,使其能夠識別并攻擊體內帶有cd22抗原的腫瘤細胞。這種方法具有許多優點,例如能夠克服傳統免疫療法中存在的局限性,并且能減少對正常組織細胞的損害,目前在對cd22?car-m的吞噬腫瘤能力研究中，均使用表達cd22的懸浮細胞作為靶向對象。car-m能通過其胞外的scfv，特異性的地識別并結合腫瘤的標志物，從而達到吞噬殺傷腫瘤的效果。
2、然而，目前表達cd22的腫瘤細胞，多為懸浮細胞居多，即使是被報道表達cd22的乳腺癌和肺癌細胞，其表達量相也只有懸浮細胞的0.5％。但為了更好的研究cd22?car-m對實體瘤特殊的吞噬殺傷能力，所以在car-m功能研究中，還需要一個能穩定表達cd22的實體瘤細胞作為靶向對象。
技術實現思路
1、本專利技術基于piggybac質粒載體系統，設計出cd22表達質粒，并使用轉染試劑將該質粒系統轉染至b16細胞中。通過流式分選儀對熒光表達陽性的細胞進行單克隆分選，再從單克隆細胞株不斷擴培，最終使用抗體去檢測cd22的表達。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種表達人源cd22的b16細胞的方法，其方法包括以下步驟：
3、s1、質粒構建
4、(一)實驗器材：
5、瓊脂糖，g
6、(二)實驗步驟：
7、①使用表一中的引物1與引物2，按照表二的反應程序，以課題組內質粒庫中質粒為模板，pcr得到cd22-p2a-mcherry片段，使用pcr產物回收試劑盒將片段回收；
8、表一cd22-p2a-mcherry引物
9、
10、表二cd22-p2a-mcherry片段pcr反應程序
11、
12、②使用表三內限制性核酸內切酶，按照表四反應程序，對組內pb載體質粒進行酶切，使用pcr產物回收試劑盒將片段回收；
13、表三pb載體雙酶切
14、
15、表四限制性內切酶反應程序
16、
17、③使用同源重組酶，按照表六比例混合上述得到的核酸片段；
18、④使用dh5α將同源重組產物進行轉化；
19、⑤挑取單菌落擴培，并送樣測序；
20、⑥使用去內毒素質粒提取試劑盒，提取質粒，用于后續轉染；
21、s2、細胞轉染
22、(一)實驗器材：
23、2000試劑，opti-men培養基，1640無抗生素培養基，1640完全培養基，pb-cd22-p2a-mcherry質粒，b16細胞，24孔板；
24、(二)實驗方案：
25、①提前一晚，24孔板，每孔1×105個b16細胞，加入800μl1640完全培養基培養；
26、②實驗前將每孔的培養基更換為無雙抗培養基；
27、③將lipo2000試劑充分顛倒混勻，使用50μl?opti-mem培養基稀釋1.6μllipofectamine試劑，靜置5min；
28、④使用50μl?opti-mem培養基稀釋0.8μg質粒，靜置5min；
29、⑤將稀釋的lipo2000試劑逐滴加入稀釋的dna中，即，1:1比例，再吹打混勻，室溫靜置15min；
30、⑥再次充分混勻dnalipo2000混合液，向每孔細胞添加50μl?dna脂質復合物；
31、⑦6h后給使用完全培養基細胞進行換液，24h后熒光顯微鏡觀察細胞轉染效率；
32、s3、單克隆培養
33、(一)實驗器材：
34、bd流式細胞分選儀，96孔板，24孔板，2％雙抗1640完全培養基；
35、(二)實驗方案：
36、①96孔板中加入100μl?2％雙抗的1640完全培養基；
37、②使用bd流式細胞分選儀，將轉染陽性的細胞分選至96孔板中，每個孔1個細胞；
38、③觀察細胞生長情況，待長滿96孔板，并且保持陽性信號，則擴培至24孔板中。
39、優選的，步驟s1中，pcr儀中50℃反應15min。
40、優選的，步驟s2中，每個孔使用的最終試劑為1.6μl。
41、優選的，步驟s2中，最終每孔質粒為0.3μg。
42、與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：
43、1、本專利技術基于piggybac質粒載體系統，設計出cd22表達質粒，并使用轉染試劑將該質粒系統轉染至b16細胞中；
44、2、通過流式分選儀對熒光表達陽性的細胞進行單克隆分選，再從單克隆細胞株不斷擴培，最終使用抗體去檢測cd22的表達。
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1.一種表達人源CD22的B16細胞的方法，其特征在于：其方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種表達人源CD22的B16細胞的方法，其特征在于：步驟S1中，PCR儀中50℃反應15min。
3.根據權利要求1所述的一種表達人源CD22的B16細胞的方法，其特征在于：步驟S2中，每個孔使用的最終試劑為1.6μL。
4.根據權利要求1所述的一種表達人源CD22的B16細胞的方法，其特征在于：步驟S2中，最終每孔質粒為0.3μg。
【技術特征摘要】
1.一種表達人源cd22的b16細胞的方法，其特征在于：其方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種表達人源cd22的b16細胞的方法，其特征在于：步驟s1中，pcr儀中50℃反應15min。
3.根據權利要...
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