【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及一種新鑒定的細(xì)胞外囊泡(ev)支架蛋白，其可有利地用于基因工程化的細(xì)胞外囊泡。本專利技術(shù)還涉及所述基因工程化ev在治療中的用途、該ev的生產(chǎn)和純化方法、該ev群體以及編碼新支架蛋白的多肽和多核苷酸構(gòu)建體、以及包含那些多肽或多核苷酸構(gòu)建體的細(xì)胞。
技術(shù)介紹
1、通常，ev(例如外泌體)是大多數(shù)細(xì)胞類型產(chǎn)生的納米尺寸的囊泡，作為機(jī)體的細(xì)胞之間蛋白質(zhì)、核酸、肽、脂質(zhì)和各種其他分子的天然轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。ev具有多種潛在的治療用途，有望作為蛋白質(zhì)、核酸和小分子治療物的天然遞送載體。將ev工程化以包含目標(biāo)蛋白(poi)對于ev遞送治療貨物(cargo)的效用至關(guān)重要；然而，鑒定合適的ev蛋白作為融合伴侶將治療貨物轉(zhuǎn)運(yùn)到ev中已被證明是困難和不可預(yù)測的。
2、裝載目標(biāo)治療性分子可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)。在最簡單的情況下，來自本身具有治療潛力的生產(chǎn)細(xì)胞(如免疫調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞和嵌合抗原受體t細(xì)胞)的小型ev可以被動裝載治療性分子，從而可以直接用于疾病管理。另外，利用孵育、超聲處理和電穿孔等物理和化學(xué)方法進(jìn)行外源治療性分子的裝載方法也得到了廣泛應(yīng)用。然而，該策略僅限于小rna(例如，sirna、mirna、shrna)和低分子量化學(xué)品，并且具有相當(dāng)大的技術(shù)偽影(例如rna沉淀)風(fēng)險。另一方面，poi通常通過基因工程裝載到小型ev中。在典型的工作流程中，工程化生產(chǎn)細(xì)胞以過表達(dá)融合至ev分選/載體結(jié)構(gòu)域的所需蛋白，該結(jié)構(gòu)域促進(jìn)poi在其生物生成過程中分選至ev。此外，潛在的rna治療劑可以通過使用兼容的rna結(jié)合蛋白經(jīng)由相同的策略間接
3、取決于用于將poi攜帶到工程化ev中的ev蛋白(所謂的“支架結(jié)構(gòu)域”或“支架蛋白”)的拓?fù)鋵W(xué)和亞細(xì)胞定位，以及用于融合的末端，貨物分子可以展示在ev表面或裝載到囊泡中。與表面展示相反，囊泡內(nèi)裝載可以保護(hù)貨物分子免于過早釋放以及快速降解。先前報(bào)道的用于囊泡內(nèi)裝載的ev支架結(jié)構(gòu)域主要分為三大類：細(xì)胞質(zhì)蛋白(sdcb-1、arrdc1和basp1)、單跨膜蛋白(lamp2b和ptgfrn)和四跨膜蛋白(cd9、cd63和cd81)。
4、傳統(tǒng)上，認(rèn)為在ev中天然高表達(dá)的“常見”或“經(jīng)典”ev蛋白，是作為“支架”以將poi攜帶到工程化ev中的最佳ev蛋白。生成ev蛋白-poi的融合蛋白已顯示出作為將所選poi裝載到ev的有效方法。如上所述，經(jīng)典的ev蛋白(如cd63、cd9和cd81)以及單跨膜ev蛋白(如lamp2)，甚至膜相關(guān)ev蛋白(如basp)先前都已被證明可用作poi的融合伴侶。
5、然而，上述結(jié)構(gòu)域的ev分選效率依賴于生產(chǎn)細(xì)胞能否持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)特定的支架結(jié)構(gòu)域，以及該結(jié)構(gòu)域所攜帶的貨物分子的特定的類型和大小，此前這些因素導(dǎo)致了高度可變的結(jié)果。
6、例如，已知轉(zhuǎn)基因cd63-poi的表達(dá)在生產(chǎn)細(xì)胞中會隨著時間的推移而顯著下降，從而影響ev產(chǎn)物的產(chǎn)量。換句話說，當(dāng)使用cd63作為ev支架蛋白時，即使生成了穩(wěn)定的細(xì)胞系，該細(xì)胞系的穩(wěn)定性也存在很大的可變性，并隨著時間的推移逐漸下降，導(dǎo)致更少的任一ev上的cd63-poi融合構(gòu)建體，以及更少的包含任何轉(zhuǎn)基因融合蛋白構(gòu)建體的ev。
7、此外，當(dāng)工程化cd63使其與多于一個poi融合(例如，不同的poi融合至n末端、c末端、第一環(huán)和/或第二環(huán)融合)時，表達(dá)cd63融合構(gòu)建體的ev數(shù)量以及每個ev上表達(dá)的cd63融合構(gòu)建體數(shù)量都會減少。
8、因此，仍然存在改進(jìn)將poi引入ev的方法的需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、除了上述已知限制外，本專利技術(shù)人還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)需要在治療性ev中加入額外的蛋白質(zhì)或融合蛋白構(gòu)建體時，使用這些經(jīng)典ev蛋白就會出現(xiàn)問題。例如，構(gòu)建始終表達(dá)多于一種將在同一ev群體上或同一ev群體內(nèi)表達(dá)的poi的雙穩(wěn)定細(xì)胞系是不可能的。本專利技術(shù)人發(fā)現(xiàn)，如果使用cd63、cd9或cd81等“經(jīng)典ev蛋白”生產(chǎn)雙穩(wěn)定細(xì)胞系，那么第二個構(gòu)建體的表達(dá)將很快下降(例如，cd63-poi與另一個poi(如vsvg)共表達(dá)將迅速導(dǎo)致vsvg表達(dá)喪失)；結(jié)果是產(chǎn)生的ev群體將很快僅含有包含“經(jīng)典ev蛋白”的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。由于生產(chǎn)一致的ev生產(chǎn)細(xì)胞系的不可能的，對于治療性ev包含多于一個poi的需求來說，這當(dāng)然有問題。其原因尚不清楚。
2、因此，盡管發(fā)現(xiàn)工程化經(jīng)典的ev蛋白(如cd63、cd81和cd9)以包含poi后可在天然ev/外泌體上高表達(dá)，但也發(fā)現(xiàn)它們會阻礙后續(xù)(不同)蛋白質(zhì)引入相同ev，從而防止多個蛋白構(gòu)建體在相同ev上的共定位。這嚴(yán)重限制了可引入ev的蛋白質(zhì)組合，因此無法實(shí)現(xiàn)功能的多重化。這也限制了作為平臺技術(shù)的治療性ev的發(fā)展，并大大降低了工程化ev的效用。
3、此外，盡管理論上可以工程化經(jīng)典的四跨膜ev蛋白(如cd63)，使其包含多個poi(即在n末端、c末端、第一環(huán)和/或第二環(huán)上)，但已發(fā)現(xiàn)工程化這些經(jīng)典的四跨膜ev蛋白以融合包含多個poi(例如，將不同的poi分別融合到n末端、c末端、第一環(huán)和/或第二環(huán)上)，會導(dǎo)致表達(dá)這些融合構(gòu)建體的ev數(shù)量減少，以及每個ev中表達(dá)這些融合構(gòu)建體的數(shù)量減少。
4、因此，仍然需要將多個poi引入ev的新方法。
5、為了解決這些限制并應(yīng)對基因工程的未來挑戰(zhàn)，需要鑒定新的ev分選結(jié)構(gòu)域。因此，本專利技術(shù)源于旨在發(fā)現(xiàn)新型ev分選結(jié)構(gòu)域的研究并研究了幾種生產(chǎn)細(xì)胞與貨物分子之間的差異。
6、本專利技術(shù)的一個目的是克服上述與尋找新的ev載體/支架蛋白相關(guān)的問題，所述ev載體/支架蛋白可用作融合伴侶以將poi轉(zhuǎn)運(yùn)至ev中，并且在較長時間內(nèi)具有高效率和可靠性。本專利技術(shù)人希望鑒定出新型的ev載體/支架蛋白，它們可作為“通用ev載體/支架蛋白”，即對多種細(xì)胞類型有效，并能攜帶多種貨物。
7、第二，本專利技術(shù)的一個目的是識別能夠維持ev-蛋白質(zhì)-poi融合構(gòu)建體的表達(dá)并且不阻礙第二或后續(xù)poi在同一ev上共定位的ev支架/載體蛋白。本專利技術(shù)人尋求鑒定出一種替代的支架蛋白，這種蛋白能夠工程化以包含poi，同時允許工程化第二或更多蛋白以在同一ev內(nèi)/上，即允許共定位。
8、此外，本專利技術(shù)人還尋求鑒定出能夠被工程化以包含多個poi的ev支架/載體蛋白，并且在以這種方式工程化后，在ev中持續(xù)以高水平表達(dá)。
9、此外，本專利技術(shù)人一直致力于鑒定出能夠增加貨物(包括rna在內(nèi))裝載到ev中的支架蛋白。
10、為此，本專利技術(shù)人對ev蛋白進(jìn)行了大規(guī)模篩選，并鑒定出一種新型且高度柔性的支架蛋白tspan2，與經(jīng)典ev蛋白不同，其能夠開發(fā)高度靈活、因此具有多樣化應(yīng)用的技術(shù)平臺。與經(jīng)典ev蛋白相比，tspan2作為ev支架蛋白的功能顯著改善(提高達(dá)10倍)，并且通過使其他蛋白構(gòu)建體能夠在同一ev中共定位，顯著提高了這種治療性外泌體平臺技術(shù)的模塊化。
11、此外，與經(jīng)典的ev四跨膜蛋白cd63相比，tspan2和tspan3都能增加mrna裝載。此外，與表達(dá)融合了poi的經(jīng)典ev四跨膜蛋白cd63相本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種包含融合蛋白的細(xì)胞外囊泡(EV)，其特征在于，所述融合蛋白包含與目標(biāo)蛋白(POI)融合的TSPAN2。
2.如權(quán)利要求1所述的EV，其特征在于，所述POI被工程化到TSPAN2的環(huán)1、環(huán)2或兩個環(huán)中。
3.如權(quán)利要求1或2所述的EV，其特征在于，所述POI與TPSAN2的N-末端結(jié)構(gòu)域(NTD)或C-末端結(jié)構(gòu)域(CTD)或其他管腔部分融合。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的EV，其特征在于，所述融合蛋白進(jìn)一步包含：
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的EV，其特征在于，所述EV進(jìn)一步包含在單獨(dú)的構(gòu)建體上表達(dá)的第二POI。
6.如權(quán)利要求5所述的EV，其特征在于，所述第二POI作為與外泌體多肽的融合蛋白存在。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的EV，其特征在于，所述POI為：
8.如權(quán)利要求7所述的EV，其中所述治療性蛋白選自：酶、受體(任選誘餌受體)、膜蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞因子、抗原、新抗原、免疫效應(yīng)分子、核糖核蛋白、核酸結(jié)合蛋白、抗體、納米抗體、抗體片段、抗體-藥物綴合物、基因編輯蛋白(任選CRIS
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的EV，其特征在于，所述EV可通過包括進(jìn)一步用治療性貨物外源地裝載所述EV的方法獲得。
10.如權(quán)利要求9所述的EV，其特征在于，進(jìn)一步用治療性貨物外源地裝載所述EV的步驟是通過電穿孔、轉(zhuǎn)染試劑、共孵育或與細(xì)胞穿透肽(CPP)接觸或其任意組合。
11.如權(quán)利要求9或10所述的EV，其特征在于，所述治療性貨物為蛋白質(zhì)、核酸、病毒、病毒基因組、抗原或小分子。
12.如權(quán)利要求11所述的EV，其中核酸貨物為：RNA分子、DNA分子或混合體、任選地為mRNA、反義或剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸、gRNA、siRNA、shRNA、miRNA、dbDNA、質(zhì)粒DNA(pDNA)、超螺旋或非超螺旋質(zhì)粒或迷你環(huán)。
13.如權(quán)利要求5所述的EV的群體，其特征在于，TSPAN2-POI融合蛋白和所述第二POI構(gòu)建體在同一EV上表達(dá)。
14.一種包含與POI融合的TSPAN2的多肽構(gòu)建體。
15.一種編碼如權(quán)利要求14所述的多肽構(gòu)建體的多核苷酸構(gòu)建體。
16.一種細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求14所述的多肽構(gòu)建體或如權(quán)利要求15所述的多核苷酸構(gòu)建體。
17.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，進(jìn)一步包含能夠表達(dá)POI的第二多肽構(gòu)建體或多核苷酸構(gòu)建體。
18.一種藥物組合物，包含如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的EV、如權(quán)利要求13所述的EV的群體或如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。
19.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的EV的方法，所述方法包括：
20.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求5所述的EV的方法，所述方法包括：
21.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的EV用于醫(yī)藥。
22.一種治療方法，包括向有需要的患者施用有效量的如權(quán)利要求1-12所述的EV或如權(quán)利要求18所述的藥物組合物。
...【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
1.一種包含融合蛋白的細(xì)胞外囊泡(ev)，其特征在于，所述融合蛋白包含與目標(biāo)蛋白(poi)融合的tspan2。
2.如權(quán)利要求1所述的ev，其特征在于，所述poi被工程化到tspan2的環(huán)1、環(huán)2或兩個環(huán)中。
3.如權(quán)利要求1或2所述的ev，其特征在于，所述poi與tpsan2的n-末端結(jié)構(gòu)域(ntd)或c-末端結(jié)構(gòu)域(ctd)或其他管腔部分融合。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的ev，其特征在于，所述融合蛋白進(jìn)一步包含：
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的ev，其特征在于，所述ev進(jìn)一步包含在單獨(dú)的構(gòu)建體上表達(dá)的第二poi。
6.如權(quán)利要求5所述的ev，其特征在于，所述第二poi作為與外泌體多肽的融合蛋白存在。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的ev，其特征在于，所述poi為：
8.如權(quán)利要求7所述的ev，其中所述治療性蛋白選自：酶、受體(任選誘餌受體)、膜蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞因子、抗原、新抗原、免疫效應(yīng)分子、核糖核蛋白、核酸結(jié)合蛋白、抗體、納米抗體、抗體片段、抗體-藥物綴合物、基因編輯蛋白(任選crispr-cas)、talens和大范圍核酸酶。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的ev，其特征在于，所述ev可通過包括進(jìn)一步用治療性貨物外源地裝載所述ev的方法獲得。
10.如權(quán)利要求9所述的ev，其特征在于，進(jìn)一步用治療性貨物外源地裝載所述ev的步驟是通過電穿孔、轉(zhuǎn)染試劑、共孵育或與細(xì)胞穿透肽(cpp)接觸或其任意組合。
11...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：梁修明，D·古普塔，J·諾丁，S·埃爾安達(dá)魯西，鄭雯益，牛哲禹，J·A·拉德勒，
申請(專利權(quán))人：醫(yī)福斯治療有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。