【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程，尤其涉及一種提高微生物生產氨基酸的方法。
技術介紹
1、賴氨酸是動物的必需氨基酸之一，廣泛應用于飼料、食品、醫藥等領域，尤其在飼料領域的需求量較大，因此，提高賴氨酸的產量具有重要意義。
2、目前，谷氨酸棒桿菌(corynebacterium?glutamicum)是微生物發酵法生產賴氨酸最常用的生產菌。谷氨酸棒桿菌用于生產氨基酸的歷史可追溯到20世紀60年代，隨著代謝工程技術和基因組測序技術的快速發展，對谷氨酸棒桿菌的代謝路徑研究越來越清晰。氨基酸的高效生產可通過很多途徑來實現，例如解除產物的反饋抑制、強化末端合成途徑的關鍵酶、提高產物外運的效率、增強底物的攝取速率、增強輔因子的供應、優化中央代謝的碳流分配、阻斷競爭支路以及進行全局調控等。然而，細菌是一種非常復雜的細胞代謝工廠，除以上理性判斷的靶點外，仍有很多未知的基因或蛋白直接或間接地影響氨基酸的生產效率。為進一步提高微生物的賴氨酸產量，仍需開發新的能夠促進賴氨酸生產的蛋白或基因。
技術實現思路
1、本專利技術提供一種提高微生物生產氨基酸的方法。
2、本專利技術在對微生物發酵生產賴氨酸的研究過程中意外地發現，氨基酸序列如seqid?no.4所示的硫酯酶家族蛋白與賴氨酸的產量存在明顯的相關性，并發現含有特定突變位點的硫酯酶家族蛋白突變體能夠明顯促進微生物合成、積累賴氨酸，進而顯著提升賴氨酸的產量。對于氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白，目前尚未見該蛋白或其突變體對
3、基于上述發現，本專利技術提供以下技術方案：
4、第一方面，本專利技術提供硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在構建用于生產賴氨酸或其衍生物的微生物中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
5、第二方面，本專利技術提供硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在微生物發酵生產賴氨酸或其衍生物中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
6、第三方面，本專利技術提供硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在提高微生物生產賴氨酸或其衍生物的產量中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
7、以上所述的氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白來源于谷氨酸棒桿菌，其ncbi參考序列編號為ncgl0686，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。
8、優選地，上述應用中，所述硫酯酶家族蛋白突變體的氨基酸序列如seq?id?no.1～3任一所示。本專利技術通過實驗證明了氨基酸序列如seq?id?no.1～3所示的硫酯酶家族蛋白突變體均能夠顯著提高微生物生產賴氨酸的產量，對于提升微生物的賴氨酸生產效率具有明顯的促進作用。
9、上述應用中，對于硫酯酶家族蛋白突變體的編碼基因，根據上述提供的硫酯酶家族蛋白突變體的氨基酸序列和密碼子規則，本領域技術人員能夠獲得所述硫酯酶家族蛋白突變體的編碼基因的核苷酸序列。
10、上述應用中，所述生物材料包括表達盒、載體或宿主細胞。
11、其中，所述表達盒為將所述編碼基因與轉錄和/或翻譯調控元件可操作性地連接得到的重組核酸分子。
12、所述載體包括但不限于質粒載體、病毒載體、轉座子。
13、所述宿主細胞為任意能夠攜帶所述編碼基因或表達所述硫酯酶家族蛋白突變體的細胞，包括微生物細胞，優選為棒桿菌屬細菌(例如谷氨酸棒桿菌)、腸桿菌科細菌(例如大腸桿菌)或芽孢桿菌屬細菌(例如枯草芽孢桿菌)。
14、上述應用中，所述微生物優選為棒桿菌屬細菌。
15、進一步優選地，所述棒桿菌屬細菌為谷氨酸棒桿菌。
16、第四方面，本專利技術提供一種提高微生物生產賴氨酸或其衍生物的產量的方法，所述方法包括：對微生物進行修飾以使得其表達硫酯酶家族蛋白突變體，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
17、優選地，所述硫酯酶家族蛋白突變體的氨基酸序列如seq?id?no.1～3任一所示。
18、優選地，所述提高微生物生產賴氨酸或其衍生物的產量的方法包括：對微生物基因組中的原始硫酯酶家族蛋白基因進行突變，以使得其編碼硫酯酶家族蛋白突變體；所述微生物基因組中的原始硫酯酶家族蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
19、優選地，上述方法中，所述微生物為棒桿菌屬細菌。
20、進一步優選地，所述棒桿菌屬細菌為谷氨酸棒桿菌。
21、第五方面，本專利技術提供一種產賴氨酸的微生物，所述產賴氨酸的微生物表達硫酯酶家族蛋白突變體，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
22、優選地，所述產賴氨酸的微生物表達氨基酸序列如seq?id?no.1～3任一所示的硫酯酶家族蛋白突變體。
23、優選地，所述產賴氨酸的微生物不表達氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白。
24、優選地，所述微生物為棒桿菌屬細菌。更優選為谷氨酸棒桿菌。
25、上述產賴氨酸的微生物可通過以下方法構建得到：以能夠合成賴氨酸的微生物為出發菌株，對出發菌株基因組中的氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白基因進行突變，以使得其編碼所述硫酯酶家族蛋白突變體。
26、在本專利技術的一些實施方式中，所述出發菌株為野生型谷氨酸棒桿菌，包括但不限于谷氨酸棒桿菌模式菌atcc13032。谷氨酸棒桿菌atcc?13032的遺傳信息已在genbank中公開，可登錄以下網站進行查詢：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_003450.3。
27、在本專利技術的一些實施方式中，所述出發菌株為谷氨酸棒桿菌cgmcc?no.11942，該菌株是一株賴氨酸生產菌，已于2015年12月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為：谷氨酸棒桿菌corynebacterium?glutamicum，該菌株已在專利cn105734004b中公開。
28、在本專利技術的一些實施方式中，所述出發菌株為谷氨酸棒桿菌cgmcc?no.13407，該菌株是一株賴氨酸生產菌，已于2016年11月30日保藏在中國微本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在構建用于生產賴氨酸或其衍生物的微生物中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
2.硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在微生物發酵生產賴氨酸或其衍生物中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如SEQ?IDNO.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
3.硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在提高微生物生產賴氨酸或其衍生物的產量中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
4.根據權利要求1～3任一項所述的應用，其特征在于，所述硫酯酶家族蛋白突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1～3任一所示。
5.根據權利要求1～3任一項所述的應用，其特征在于，所述生物材料
6.根據權利要求1～3任一項所述的應用，其特征在于，所述微生物為棒桿菌屬細菌。
7.一種提高微生物生產賴氨酸或其衍生物的產量的方法，其特征在于，所述方法包括：對微生物進行修飾以使得其表達硫酯酶家族蛋白突變體，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述硫酯酶家族蛋白突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1～3任一所示。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：對微生物基因組中的原始硫酯酶家族蛋白基因進行突變，以使得其編碼所述硫酯酶家族蛋白突變體；
10.根據權利要求7～9任一項所述的方法，其特征在于，所述微生物為棒桿菌屬細菌。
...【技術特征摘要】
1.硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在構建用于生產賴氨酸或其衍生物的微生物中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
2.硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在微生物發酵生產賴氨酸或其衍生物中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如seq?idno.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
3.硫酯酶家族蛋白突變體或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料在提高微生物生產賴氨酸或其衍生物的產量中的應用，所述硫酯酶家族蛋白突變體與氨基酸序列如seq?id?no.4所示的硫酯酶家族蛋白相比，含有第23位纈氨酸突變為丙氨酸、甘氨酸或蘇氨酸的突變。
4.根據權利要求1～3任一項所述的應用，其特征在于，所述硫酯酶家族蛋白突變體的氨基酸序列如seq?i...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡丹，王亞迪，馮帆，趙津津，李巖，
申請(專利權)人：廊坊梅花生物技術開發有限公司，
類型：發明
國別省市：
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